胃癌是全球第六大常見癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。全球每年新確診胃癌病例達100萬，死亡病例約為80萬。腹膜轉(zhuǎn)移（PM）是胃癌患者最常見的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移形式。大約53-66%的遠處轉(zhuǎn)移性胃癌患者伴有腹膜轉(zhuǎn)移，其五年生存率僅為6.0%。對于這些患者來說，常用的治療措施效果不理想，而抑制性腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）限制了免疫治療的效果。

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院魏嘉教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊近日發(fā)現(xiàn)，腹腔注射IL-33可以誘導(dǎo)腹腔炎癥環(huán)境，激活免疫效應(yīng)細胞，逆轉(zhuǎn)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，從而延緩胃癌進展和腹膜轉(zhuǎn)移。

這項題為“Macrophages reprogramming improves immunotherapy of IL-33 in peritoneal metastasis of gastric cancer”的研究成果于2024年1月發(fā)表在《EMBO Molecular Medicine》雜志上，為治療轉(zhuǎn)移性腹膜惡性腫瘤提供了一種大有前景的新方法。
 

圖片來源：《EMBO Molecular Medicine》
（https://doi.org/10.1038/s44321-023-00012-y）

研究材料與方法
在本研究中，研究人員將小鼠前胃癌（MFC）細胞注射到615系小鼠體內(nèi)，構(gòu)建腹膜散播性腫瘤模型，并利用IL-33來治療。他們比較了腫瘤大小、免疫細胞的豐度和促炎細胞因子的水平。之后，他們對小鼠腫瘤開展RNA測序分析，以篩選關(guān)鍵基因和通路。他們還通過體內(nèi)和體外分析確定了IL-33對巨噬細胞極化的影響。在評估IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用的效果時，研究人員委托賽業(yè)生物設(shè)計了熒光素酶報告基因的慢病毒載體，并用它來感染MFC細胞。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建腹膜散播性腫瘤小鼠模型，評估IL-33的治療效果和免疫環(huán)境
02 對小鼠腫瘤開展RNA測序分析，篩選關(guān)鍵的基因和通路
03 通過體外和體內(nèi)實驗評估IL-33對巨噬細胞極化的影響，并確定其作用機制
04 在多個模型中評估IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用的抗腫瘤效果

研究結(jié)果
1 IL-33延緩胃癌小鼠模型的腫瘤生長
白細胞介素-33（IL-33）是IL-1超家族中的一個重要成員，以往的研究表明這種細胞因子能增強抗腫瘤免疫力并抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。于是，研究團隊決定嘗試腹腔局部注射IL-33，以激活腫瘤免疫微環(huán)境并增強抗腫瘤免疫力。

首先，研究人員評估了IL-33 mRNA在正常組織、腫瘤組織及惡性腹水的腫瘤細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)腹水腫瘤細胞中的IL-33 mRNA表達量下降。此外，與IL-33 mRNA低表達的胃癌患者相比，高表達的胃癌患者的中位總生存期和中位無進展生存期明顯延長。

基于此，他們進一步評估了IL-33在腹腔散播性腫瘤中的作用。他們在615系小鼠體內(nèi)注射經(jīng)過慢病毒感染的MFC細胞（慢病毒由賽業(yè)生物提供），構(gòu)建了腹膜散播性腫瘤模型，然后用mIL-33或PBS來處理小鼠。他們發(fā)現(xiàn)，IL-33治療組的腹腔散播性腫瘤和腸系膜散播性腫瘤顯著減少，腫瘤重量也有所減輕（圖1）。與對照組小鼠相比，IL-33治療組小鼠的中位生存期延長。這些結(jié)果表明，IL-33的局部腹腔注射能夠有效觸發(fā)腹腔散播性胃癌的抗腫瘤效應(yīng)。
 

IL-33可延緩腫瘤生長，促進腹膜免疫細胞的浸潤和激活，并誘導(dǎo)局部炎癥環(huán)境^[1]

同時，研究人員在治療終點收集小鼠腫瘤和脾臟并開展流式分析，以評估IL-33對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。與對照組相比，IL-33治療組的腹腔腫瘤中的CD8+ T細胞、NK細胞、巨噬細胞和M2型巨噬細胞浸潤顯著增加，但M1型巨噬細胞無顯著差異。免疫細胞中的IFN-γ水平也提高（圖1），表明IL-33激活了免疫細胞的抗腫瘤作用。

此外，IL-33處理組的促炎細胞因子水平升高，表明它可誘導(dǎo)局部炎癥環(huán)境。之后，他們對小鼠腫瘤進行了RNA測序分析。GO和KEGG分析顯示，IL-33治療組小鼠的差異基因明顯集中在吞噬相關(guān)通路和免疫反應(yīng)通路。基因集富集分析（GSEA）也表明，吞噬識別、T細胞活化、NK細胞介導(dǎo)的細胞毒性和NF-κB信號通路在實驗組中富集。這些數(shù)據(jù)證明了IL-33介導(dǎo)的局部炎癥環(huán)境誘導(dǎo)了腹腔巨噬細胞的招募和腫瘤免疫環(huán)境的激活。

2 IL-33誘導(dǎo)巨噬細胞的M2極化
為了進一步評估IL-33對巨噬細胞表型和功能的影響，研究人員利用小鼠和人類的巨噬細胞開展體外實驗。小鼠巨噬細胞系RAW264.7經(jīng)過IL-33處理后，CD80和iNOS（M1型巨噬細胞標(biāo)志物）的表達率增加，而CD163和CD206（M2型巨噬細胞標(biāo)志物）的表達也上調(diào)。這些結(jié)果表明，IL-33在體外誘導(dǎo)巨噬細胞同時向M1和M2表型極化，這與體內(nèi)觀察到的結(jié)果不完全一致。研究人員推測，腹腔腫瘤免疫微環(huán)境處于一種高度免疫抑制的狀態(tài)，多個免疫抑制細胞因子和趨化因子高度表達，導(dǎo)致IL-33在體內(nèi)無法誘導(dǎo)M1極化。

之后，為了探究IL-33誘導(dǎo)巨噬細胞極化的機制，研究人員對IL-33的關(guān)鍵下游信號通路開展分析，包括NF-κB p65、p44/42 MAPK和p38。通過采用相關(guān)通路的抑制劑，他們發(fā)現(xiàn)NF-κB p65和p44/42 MAPK信號通路在巨噬細胞的M1極化中起作用。當(dāng)這些通路被抑制時，巨噬細胞傾向于發(fā)生M2極化。相反，激活p38信號通路可促進巨噬細胞的M2極化。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，IL-33能夠通過p38依賴的機制增強GATA結(jié)合蛋白3（GATA3）的表達。在本研究中，他們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過IL-33刺激的RAW264.7細胞中，GATA3水平顯著升高，而在加入p38抑制劑（SB203580）后，GATA3表達水平下降。在利用shRNA敲降GATA3后，CD163表達顯著下降，這表明GATA3在IL-33誘導(dǎo)的巨噬細胞重編程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用可增強抗腫瘤反應(yīng)
最后，研究人員在多個模型中研究了IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用的抗腫瘤策略，CSF1R抗體可減少腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）的數(shù)量，促進巨噬細胞極化的重編程。體內(nèi)生物發(fā)光成像（BLI）顯示，與單藥治療組相比，IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用可有效抑制熒光素酶介導(dǎo)的MFC細胞的腹腔擴散。聯(lián)合治療組的腫瘤數(shù)量顯著減少，凸顯了進一步的抗腫瘤效果（圖2）。后續(xù)分析顯示，IL-33能引發(fā)M2型巨噬細胞在腫瘤組織內(nèi)的聚集，而IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用能增強腹腔散播性胃癌的抗腫瘤反應(yīng)。
 

IL-33與CSF1R抗體聯(lián)用可增強小鼠模型的抗腫瘤反應(yīng)^[1]

同樣地，他們還評估了IL-33與p38抑制劑聯(lián)用的治療效果。與單藥治療組相比，聯(lián)合治療使得小鼠腹腔腫瘤重量顯著減輕，且腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少。結(jié)合后續(xù)分析，他們發(fā)現(xiàn)抑制p38信號通路可將巨噬細胞從M2表型重編程為M1表型。因此，IL-33與p38抑制劑聯(lián)用可協(xié)同增強腹腔散播性胃癌的抗腫瘤反應(yīng)。

研究結(jié)論

IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑聯(lián)用發(fā)揮抗腫瘤作用的示意圖^[1]

總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，IL-33可驅(qū)動免疫效應(yīng)細胞的招募和活化，促進抗腫瘤促炎細胞因子的表達，將腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)重編程為免疫激活狀態(tài)，抑制腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。不過，IL-33也會通過p38-GATA3信號通路誘導(dǎo)M2極化，從而促進腫瘤進展和炎癥消退。因此，IL-33與CSF1R抗體或p38抑制劑的聯(lián)用可以避免IL-33誘導(dǎo)的M2極化，具有協(xié)同抗腫瘤作用。

參考文獻：
[1]Che K, Luo Y, Song X, Yang Z, Wang H, Shi T, Wang Y, Wang X, Wu H, Yu L, Liu B, Wei J. Macrophages reprogramming improves immunotherapy of IL-33 in peritoneal metastasis of gastric cancer. EMBO Mol Med. 2024 Feb;16(2):251-266. https://doi.org/10.1038/s44321-023-00012-y