實(shí)驗(yàn)第一步，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)！
不同的實(shí)驗(yàn)方法需要設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)分組也是不一樣噠，常見(jiàn)的幾種分組簡(jiǎn)單整理如下哦~  


通常情況下，每組實(shí)驗(yàn)至少需要設(shè)置 3-5 個(gè)平行，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

注意：以上是常規(guī)的分組思路，一些特殊實(shí)驗(yàn)方法可能需要設(shè)置更多的分組 (如 LDH 細(xì)胞活力檢測(cè))，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn) Protocol 是一個(gè)好習(xí)慣哦！

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)好了，要開(kāi)始實(shí)驗(yàn)了，檢查一下我們的試劑/儀器準(zhǔn)備好了嗎？

• 細(xì)胞系、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素，有條件的小伙伴也可以直接購(gòu)買完全培養(yǎng)基哦~
• 96 孔板、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑、無(wú)菌槍頭、無(wú)菌離心管、無(wú)菌水、無(wú)菌 PBS 等。
• 酶標(biāo)儀。

一切準(zhǔn)備就緒，我們來(lái)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇吧~

 

【細(xì)胞復(fù)蘇】

取一支凍存細(xì)胞，在 37℃ 水浴中快速解凍。迅速轉(zhuǎn)移至 10 mL 完全培養(yǎng)基中，800 rpm 3 min 常溫離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，并置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(更多細(xì)胞復(fù)蘇 tips，請(qǐng)參考往期推文：干貨分享 | 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇避坑指南)
注意: 不同凍存液細(xì)胞復(fù)蘇可能有差異，還是那句話，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前要詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)或?qū)嶒?yàn) Protocol！
找一個(gè)合適的時(shí)間，看看我們的細(xì)胞是不是乖乖長(zhǎng)大了？ 嗯~長(zhǎng)得還不錯(cuò) ，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷一下最佳接種細(xì)胞量以及試劑使用量吧~

【對(duì)數(shù)期細(xì)胞收集】

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)收集細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

【調(diào)整細(xì)胞密度】

使用 96 孔板時(shí)每孔加入 100 μL 細(xì)胞混懸液，設(shè)置 5-7 個(gè)細(xì)胞密度梯度，每個(gè)細(xì)胞密度設(shè)置 3-5 個(gè)復(fù)孔，確定檢測(cè)試劑所需最佳細(xì)胞密度。

啥都準(zhǔn)備好了，廢話不說(shuō)，我們上實(shí)驗(yàn)！

【正式實(shí)驗(yàn)】：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果接種細(xì)胞，置于 37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【配制藥物母液】：按照需要的實(shí)驗(yàn)藥物濃度合理配制藥物母液，使用時(shí)稀釋母液即可。

【加藥】：每孔加入相同體積不同濃度的藥物，設(shè)置藥物處理時(shí)間為 12 h、24 h、36 h、48 h 等。

【檢測(cè)】：藥物處理后選擇合適的方法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。


▐  1. CCK-8 檢測(cè)
基于 WST-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的比色檢測(cè)法，主要用于細(xì)胞活性檢測(cè)。


檢測(cè)原理： WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原成 Formazan (橙黃色)。CCK-8 為預(yù)混溶液，即開(kāi)即用。

 具體操作如下：

1） 96 孔板中每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；

2） 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1-4 h (避免放在培養(yǎng)箱邊緣位置)；

3） 酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度。

圖 1. KN93 和 Gemcitabine 對(duì) CCLP1 細(xì)胞活力影響^[1]。

CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn) KN93 可以增強(qiáng) Gemcitabine 對(duì) CCLP1 的敏感性。

 

▐  2. Cell-ATP 檢測(cè) 

也叫做 CTG 檢測(cè)，基于高靈敏度生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì) ATP 進(jìn)行定量以測(cè)定培養(yǎng)物中活細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力。



檢測(cè)原理：熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷 (ATP) 和 O₂ 為底物，在 Mg²⁺ 存在時(shí)，可將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP 在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。此方法不受化合物自發(fā)熒光的影響。

 具體操作如下：

1) 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡 10 min;

2) 96 孔板中每孔直接加入 100 μL Cell-ATP 檢測(cè)試劑; 

3) 室溫振蕩混勻 2 min，以促進(jìn)細(xì)胞充分裂解; 

4) 室溫孵育 10 min (可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整孵育時(shí)間)，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定; 

5) 使用具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定 (檢測(cè)參數(shù)可根據(jù)儀器類型及檢測(cè)靈敏度適當(dāng)調(diào)整)。

圖 2. SIPL1 對(duì) TNBC 細(xì)胞活力的影響^[2]。

CCK-8 (a) 和 CTG 發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定 (b) 用指示載體轉(zhuǎn)導(dǎo) BT-549 和 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖能力的分析。

 

▐  3. LDH 檢測(cè)

乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase, LDH) 檢測(cè)試劑盒可以在細(xì)胞膜完整性喪失進(jìn)而細(xì)胞漿內(nèi)酶釋放時(shí)檢測(cè)細(xì)胞損傷。



檢測(cè)原理：在 LDH 的作用下，乳酸被氧化成丙酮酸 (Pyruvate), NADH 和 INT 被硫辛酰胺脫氫酶催化反應(yīng)生成 NAD⁺ 和 Formazan。此方法與 CCK-8 聯(lián)用可以用于死、活細(xì)胞的同步檢測(cè)。

 具體操作如下：

注意：此方法需要設(shè)置高對(duì)照組，即在培養(yǎng)基中加入10 μL Lysis Solution。

• 間接檢測(cè)法：

1) 藥物處理細(xì)胞后，從 96 孔板每孔吸取 50 μL 上清液至新的 96 孔板中。而后在新的 96 孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution ，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度。

• 直接檢測(cè)法：

1) 96 孔板每孔吸棄 50 μL 培養(yǎng)基上清，以剩余培養(yǎng)基及細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，每孔加入 50 μL Working Solution，震蕩混勻；

2) 室溫避光孵育 30 min；

3) 每孔加入 50 μL Stop Solution，酶標(biāo)儀測(cè)定 490 nm 處的吸光度。

圖 3. OMVs 對(duì) THP-1 細(xì)胞活力的影響^[3]。
LDH 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 OMVs 不能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡及 Caspase-1 的活化。

 在細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，常見(jiàn)的數(shù)據(jù)分析方法是分析藥物處理前后 OD 值的變化，小 M 也為您整理了幾種方法~

▐  1. 細(xì)胞接種有什么要注意的嗎？
細(xì)胞接種時(shí)需要注意 96 孔板外圈不宜做實(shí)驗(yàn)用途，可以用無(wú)菌水填滿，避免培養(yǎng)導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)。
▐  2. 對(duì)數(shù)期細(xì)胞怎么確定？
每種細(xì)胞的倍增時(shí)間不一樣，在養(yǎng)細(xì)胞初期，可以做細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線來(lái)確認(rèn)細(xì)胞的倍增時(shí)間，根據(jù)細(xì)胞倍增時(shí)間推測(cè)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間。也可以在細(xì)胞匯合度達(dá)到 80% 左右時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行接種。
▐  3. 接種細(xì)胞數(shù)量怎么確定？
接種的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)藥物培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞翻倍速度來(lái)確定接種數(shù)量。
▐  4. 每次測(cè)定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？
1）當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基或無(wú)菌水，不作為測(cè)定孔用。

2）有可能會(huì)因?yàn)?CCK-8 掛壁而產(chǎn)生誤差，建議在加入 CCK-8 后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3）每孔的細(xì)胞數(shù)量過(guò)多或過(guò)少，請(qǐng)預(yù)先在 1,000～100,000 個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。

▐  5. 哪些物質(zhì)會(huì)影響 CCK-8 的測(cè)定？
當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響 CCK-8 的測(cè)定 (含有維生素 C 的 Glucose 等)。一般培養(yǎng)基中的酚紅或血清不影響測(cè)定。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測(cè)定結(jié)果，扣除空白吸收即可。
▐  6. 在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？
可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2 h 縮短為 1 h。
▐  7. CCK-8 對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般加入 CCK-8 培養(yǎng) 1-4 h 吸光度已經(jīng)很高，但懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來(lái)解決。

▐  8. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號(hào)不一樣，靈敏度可能會(huì)有輕微的差異，對(duì)于不同的批號(hào)建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
▐  9. CCK-8 能否檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞？
可以檢測(cè) E.coli，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。具體操作：向 100 μL E.coli 培養(yǎng)液中加入10 μL CCK-8 溶液，并培養(yǎng) 1-4 h 或過(guò)夜，再進(jìn)行吸光度測(cè)定。

 

[1] Fu Y, et al. Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2024 Mar 8;9(1):63.

[2] He J, et al. SIPL1, Regulated by MAZ, Promotes Tumor Progression and Predicts Poor Survival in Human Triple-Negative Breast Cancer. Front Oncol. 2021 Dec 17;11:766790. 

[3] Ye X, et al. Peptide MSI-1 inhibited MCR-1 and regulated outer membrane vesicles to combat immune evasion of Escherichia coli. Microb Biotechnol. 2023 Sep;16(9):1755-1773.