期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影響因子：38.104
主要技術：單細胞測序

導語
腺瘤到癌的發(fā)展是一個被廣泛接受的散發(fā)性結直腸癌的發(fā)展路線。然而，異常上皮細胞的細胞異質性限制了我們對結直腸組織癌變的理解。本研究對來自患者匹配的組織樣本的54,788個細胞進行了單細胞RNA測序調查，包括血液、正常組織、癌旁、息肉和結腸直腸癌。在癌變的每個階段，描述了不同細胞群的細胞類型、轉錄特征和差異表達基因。上皮細胞在正常、良性和惡性階段的分子特征。腺瘤和癌的前體細胞群被鑒定和特征化，然后通過大隊列活檢進行驗證。

研究技術
單細胞測序

研究結果
1.結直腸正常組織、腺瘤和癌組織的單細胞轉錄組分析
為了動態(tài)地分析正常腺瘤-癌序列中每種細胞類型的進化和分子特征，使用scRNA-seq技術對每個細胞群的轉錄組進行了分析（圖1a）。我們同時采集了同一例接受根治性手術的患者的血液、正常、癌旁、息肉和癌組織樣本（圖1b）。從4例未經(jīng)治療的CRC患者中收集了12例組織樣本。通過H&E染色證實了其病理情況（即腺瘤和癌）（補充圖1a)。通過體細胞變異分析，在患者匹配的腺瘤和癌中觀察到多個突變（圖1c）。這種遺傳相似性高度暗示了正常組織、腺瘤和癌之間的遺傳譜系相關性。克隆發(fā)育分析，確定了細胞群的動態(tài)變化（圖1d），進一步證實了其進化關系。這些質量檢查表明，從患者匹配的連續(xù)病變的活檢再現(xiàn)了結直腸腫瘤發(fā)生的病理進展。
 

圖 1

基于聚類、組織來源和患者來源的t-SNE圖來可視化細胞群（圖2a，b）�；�于幾個已知細胞系的典型標記基因，確定集群注釋細胞類型：腸細胞（GUCA2A）、杯狀（MUC2），腸內分泌（CHGA）、腺瘤（腺瘤上皮細胞）、上皮細胞（上皮細胞）、CD8+ T（CD8A）、濾泡輔助T（CXCR5）、中央記憶T（IL7R）、調節(jié)性T（FOXP3）、自然殺傷T（KLRD1）、濾泡B（MS4A1）、血漿B（MZB1）、M1巨噬細胞（IL1B）、M2巨噬細胞（CD163）、單核細胞（CD14）、成纖維細胞（COL1A1）、內皮細胞（VWF）和肥大細胞（KIT）（圖2c和補充圖2a、b）。采用了兩種獨立的方法來排除批處理效應的影響。我們在t-SNE圖上觀察到，來自這三個患者的腸上皮細胞和杯狀細胞分別合并在一起，突出了一種上皮亞型特異性的方式（補充圖3d）。因此，所有這些結果都保證了scRNA-seq數(shù)據(jù)滿足質量的要求，這適合于進一步的數(shù)據(jù)挖掘。盡管存在個體差異，但在所有組織和患者中均觀察到大多數(shù)細胞群（圖2d和補充圖3g）。來自不同患者的正常上皮細胞聚集在一起，這意味著它們具有相似的表達特征。相比之下，來自不同患者的異常上皮細胞（腺瘤或癌）分別聚集在一起，表現(xiàn)出高度異質性的特征，表明致癌的分子機制多樣化（圖2e）。
 

圖 2

2. 結直癌發(fā)生進化過程中的三個上皮細胞階段
為了更好地了解結直腸癌的發(fā)生，重點研究了正常、腺瘤和癌組織中的上皮細胞�？紤]到個體差異，我們分別招募了來自同一患者的上皮細胞來探索上皮細胞的進化。來自P1和P2的上皮細胞，如圖2a所示。根據(jù)惡性程度進行分類，并使用t-SNE重新繪制分析（圖3a和補充圖6a)。由于上皮細胞數(shù)量不足，我們將患者3排除在本分析之外（補充圖3g）。正常、腺瘤和癌組織的細胞明顯分離（圖3b和補充圖6b）。然后，我們根據(jù)上皮細胞的病理遺傳標記物將上皮細胞分為生理細胞、良性細胞、惡性細胞和其他群體（圖3c和補充圖6c）。非臨床結直腸上皮標記基因，包括腸上皮細胞（GUCA2A、SLC26A3和CA1）、杯狀細胞（MUC2和TFF3）、腸內分泌細胞（CHGA）和干細胞（LGR5）。細胞計數(shù)結果顯示，生理細胞、良性細胞和惡性細胞分別主要來自正常組織、腺瘤組織和癌組織（圖3d和補充圖6d）。將具有代表性的DEGs分為三組（1、2、3），與典型標記物一致，對應生理、良性和惡性分期（圖3e）。這些在CRC期間的deg的連續(xù)上調發(fā)展強調了一種時間機制，驅動從正常到良性到惡性的結直腸組織。值得注意的是，良性和惡性人群中都包含一組上調的基因（第2b組：PCCA、LEFTY1、DPEP1、ASCL2、SIVA1、MYC和OLFM4），這意味著良性人群中處于惡性中間階段。這些標記基因也為我們提供了一個研究階段過渡事件的模型（見圖4）。這些基因在P2上皮細胞中也觀察到類似的表達模式（補充圖6e）。然后，通過將基因表達數(shù)據(jù)投影到t-SNE圖中（圖3f和補充圖6f），確認了它們在組織中的分布�；�因集合變異分析（GSVA）解讀了三種細胞類型的生理和病理信號（圖3g和補充圖6g）。營養(yǎng)吸收和代謝的特征在正常細胞群中得到豐富，并與腸上皮細胞的生理功能相一致。
 

圖 3

對DEGs的分析將這些混合群體與正常、良性和惡性的上皮細胞區(qū)分開來（圖3c和補充圖6c）。然后，我們使用富集分析來描述具有異質性組織來源的細胞群的轉錄組特征。正常腺瘤的混合群體（P1和P2的Cluster9）與生理和良性群體的其余群體相比表現(xiàn)出強烈的增殖特征（圖4a和補充圖9a）。它們也沒有干細胞性特征或基底細胞特征（圖4b），排除了正常干細胞的來源。因此，這兩個簇可能是正常和腺瘤細胞之間中間階段的腺瘤前體細胞群。前體細胞群位于從生理階段到良性階段的假時間軌跡路線圖的中間位置（圖4c和補充圖9b）。接下來，我們確定了特定的標記基因來定義腺瘤前體細胞群。DEGs分析顯示，這些群體中特異性上調的基因包括HPGDS、SH2D6、HCK和BMX（圖4d和補充圖9d）。然后，我們通過檢測在癌變過程中起關鍵作用的標記蛋白BMX和SH2D6來評估活檢切片中前體群體的復發(fā)情況（圖4e）。20例患者中有9例和14例分別為腺瘤前體細胞群中BMX和SH2D6水平較高的細胞群（補充表3）。出乎意料的是，腺瘤前體細胞群P1和P2在deg中有約30%的重疊（圖4f）.
 

圖 4 

參考文獻：
[1]Single-cell transcriptomic profiling unravels the adenoma-initiation role of protein tyrosine kinases during colorectal tumorigenesis[J].Signal Transduction and Targeted Therapy[2024-04-29].DOI:10.1038/s41392-022-00881-8.