整合單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)描繪癌前病變到侵襲性肺腺癌的演變
期刊：Theranostics
影響因子：12.4
主要技術(shù)：snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
導(dǎo)語
本研究運(yùn)用運(yùn)用單細(xì)胞RNA測序 (scRNA-seq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)的綜合分析，表征肺腺癌（LUAD）侵襲過程中的動態(tài)和連續(xù)過程中涉及的細(xì)胞生態(tài)和空間生態(tài)位。研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C+癌細(xì)胞亞群在LUAD侵襲過程中不斷增加，其空間分布在浸潤性腺癌（IAC）的周邊癌區(qū)域。此外，對TME細(xì)胞類型亞群的分析顯示肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞不斷減少，這些細(xì)胞參與了侵襲性LUAD的整個過程。同時，從原位腺癌（AIS）到微浸潤腺癌（MIA）的NK細(xì)胞和MALT B細(xì)胞的增加，從MIA到IAC，Treg 細(xì)胞和分泌性B細(xì)胞有所增加。值得注意的是，對于AIS，癌細(xì)胞、NK 細(xì)胞和肥大細(xì)胞共定位于癌癥區(qū)域，對于IAC，Tregs 與癌細(xì)胞共定位。最后發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞與TME細(xì)胞誘導(dǎo)的TGF-β信號通路的通訊和相互作用參與了IAC的侵襲。研究結(jié)果揭示了癌細(xì)胞和TME亞群的特定細(xì)胞信息和空間結(jié)構(gòu)，以及它們之間的細(xì)胞相互作用，這將有助于在LUAD從AIS到IAC的侵襲過程中精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的識別和發(fā)展。
研究技術(shù)
snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
研究結(jié)果
1. LUAD細(xì)胞類型鑒定及侵襲過程中的差異表達(dá)基因
收集AIS、MIA 、IAC各3個樣本進(jìn)行scRNA-seq測序（圖1A），經(jīng)過質(zhì)控總共獲得了 115,246 個細(xì)胞，大致分為C1到C10的10 個細(xì)胞譜系，其中6種細(xì)胞類型由經(jīng)典的基因定義，包括上皮細(xì)胞、T/NK細(xì)胞、B 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞 、成纖維細(xì)胞（圖1B-C）。使用IF來校準(zhǔn)細(xì)胞的基因標(biāo)記物的表達(dá)(圖1D)。為進(jìn)一步探討LUAD侵襲過程的機(jī)制，研究人員比較了每種細(xì)胞類型的基因表達(dá)模式，MIA和AIS (M/A)組之間有512個上調(diào)和332個下調(diào)的DEG，IAC和MIA (I/M)組之間有199個上調(diào)和347個下調(diào)的 DEG，IAC和AIS (I/A)組之間有393個上調(diào)和345個下調(diào)DEG。值得注意的是，I/A 組中大約一半上調(diào)的DEG在M/A 組中已經(jīng)可檢測到（圖1E-F）。DEG 的PCA 顯示MIA和IAC在轉(zhuǎn)錄組水平上非常接近（圖1G），進(jìn)一步分析揭示了LUAD 三個不同階段的豐富細(xì)胞類型（圖1H）。
圖 1
2. 上皮細(xì)胞的亞群鑒定及LUAD的起源為確認(rèn)啟動 LUAD 侵襲的關(guān)鍵癌細(xì)胞亞簇，將上皮細(xì)胞進(jìn)一步重新聚類為8個亞群，包括Clara-like、TM4SF1+、CRABP2+、UBE2C+4個癌細(xì)胞亞群和肺泡I型、肺泡II型、Clara細(xì)胞 、纖毛細(xì)胞4個正常上皮亞群，以內(nèi)皮細(xì)胞為參考進(jìn)行CNV分析（圖2A-B）。相對于另外兩個癌細(xì)胞亞群，TM4SF1+和UBE2C+的癌細(xì)胞亞群比例在LUAD侵襲過程中不斷增加，在IAC中急劇升高，并且從AIS到MIA，UBE2C +亞型的比例變化比TM4SF1+亞型更明顯（圖2C）。IF 和bulk RNA-seq的結(jié)果也證實(shí)UBE2C +亞型癌細(xì)胞從AIS逐漸穩(wěn)定地增加到IAC（圖2D-E）。研究人員，通過TCGA-LUAD數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了UBE2C+癌細(xì)胞對LUAD患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)它可以作為預(yù)測LUAD預(yù)后的生物標(biāo)志物（圖2F）。利用ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)，UBE2C+癌細(xì)胞主要富集MYC靶點(diǎn)V1、細(xì)胞周期、AKT和TGF-β信號通路等基因集，這些細(xì)胞可能通過這些途徑促進(jìn)癌癥的進(jìn)展（圖2G）。接下來，運(yùn)用擬時序分析來破譯LUAD從正常上皮細(xì)胞到癌細(xì)胞的細(xì)胞軌跡，以揭示LUAD的起源，結(jié)果表明，UBE2C+癌細(xì)胞作為分化最差的癌細(xì)胞類型和終末細(xì)胞類型（圖2H）。
圖 2
3. UBE2C+細(xì)胞亞群參與LUAD 的整個侵襲過程為進(jìn)一步了解UBE2C+癌細(xì)胞，使用bulk RNA-seq數(shù)據(jù)驗(yàn)證UBE2C表達(dá)水平在LUAD的三個階段逐漸增加（圖3A）。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達(dá)的患者無進(jìn)展生存期和總生存期較差（圖3B）。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)UBE2C通過影響LUAD增殖和侵襲來介導(dǎo)LUAD的惡性進(jìn)展（圖3C-D）。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明UBE2C沉默顯著減弱了皮下腫瘤的生長（圖3E-G）。這些結(jié)果表明UBE2C介導(dǎo)LUAD細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
圖 3
4. LUAD侵襲中不同TME細(xì)胞亞群的研究為了探索不同TME細(xì)胞類型在LUAD侵襲過程中的變化，對主要TME細(xì)胞群進(jìn)行了進(jìn)一步研究。對T/NK細(xì)胞重新聚類為8個亞群、骨髓細(xì)胞重新聚類為10個亞群（圖4A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TPSB2 +肥大細(xì)胞和FCN1 +單核細(xì)胞占比從AIS和MIA到IAC逐漸持續(xù)下降，GNLY +NK細(xì)胞占比僅從AIS到MIA增加，而FOXP3 +Tregs的豐度從MIA到IAC顯著升高（圖4B）。通過bulk RNA-seq和IF進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞亞群變化的情況（圖4C-D）。接下來使用GSVA些細(xì)胞亞群變化中涉及的潛在標(biāo)志信號通路，細(xì)胞周期和細(xì)胞生長或增殖相關(guān)途徑，如PI3K/AKT/MTOR信號等在GNLY+NK和Foxp3+NK中高度富集，WNT和干擾素信號等在TPSB2 +肥大細(xì)胞和FCN1+單核細(xì)胞富集（圖4E-F）。因此，研究人員提出Tregs 增加和單核細(xì)胞減少介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)通路的激活可促進(jìn)早期LUAD侵襲。
圖 4
5. TGF-β信號通路在晚期LUAD的侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用CellChat分析結(jié)果揭示了LUAD中細(xì)胞之間的前十個相互作用途徑（圖5A）。在AIS和MIA中沒有觀察到癌細(xì)胞和TME細(xì)胞之間通過TGF-β信號傳導(dǎo)進(jìn)行的通訊，但這種相互作用在IAC中顯著加強(qiáng)，特別是在NK、肥大和MALT B細(xì)胞中，與之前的結(jié)果一致（圖5B)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，與AIS和MIA相比，癌細(xì)胞和TME細(xì)胞中TGF-β配體的水平在IAC中廣泛上調(diào)（圖5C）。同樣的，下游靶基因以及TGF-β途徑的下游因子p-SMAD2的表達(dá)水平在IAC中高度激活（圖5D-E）。這些結(jié)果意味著癌細(xì)胞和TME細(xì)胞之間TGF-β信號傳導(dǎo)的通訊和相互作用在IAC中誘導(dǎo)的TGF-β信號傳導(dǎo)的無限制激活可能在晚期LUAD的侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖 5
6. 癌癥區(qū)域Tregs的空間分布介導(dǎo)LUAD侵襲通過scRNA-seq分析的AIS、MIA、IAC各2個樣本進(jìn)一步進(jìn)行 ST�；贖E染色，將樣本分為四個不同的組織學(xué)區(qū)域，包括癌區(qū)域、正常上皮區(qū)域、基質(zhì)區(qū)域和淋巴區(qū)域（圖6A）。AIS樣本TD8通過ST分為四個區(qū)域（圖6B），通過marker基因的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了空間劃分的準(zhǔn)確性（圖6C）。如預(yù)期，TM4SF1+癌細(xì)胞、GNLY+NK細(xì)胞、NKG7+NK和TPSB2+肥大細(xì)胞在癌癥中共定位，但未發(fā)現(xiàn)FOXP3+ Tregs（圖6D）。同樣研究了兩例IAC 對應(yīng)的空間和細(xì)胞數(shù)據(jù)，ST也清晰的區(qū)分四個區(qū)域，與HE染色結(jié)果高度一致（圖6A-B）。TM4SF1 + 癌細(xì)胞和 UBE2C+癌細(xì)胞在癌癥區(qū)域富集，CAF（Fib-1）和 FOXP3+Tregs與癌細(xì)胞亞群共定位（圖6D）。與AIS相比，IAC的癌癥脈管系統(tǒng)區(qū)域呈現(xiàn)出更明顯的血管數(shù)量和更高表達(dá)水平的VEGFs與正常的區(qū)域相比，相反，AIS沒有明顯的差異（圖6E-G）。這一發(fā)現(xiàn)表明血管生成可能對 LUAD 的侵襲過程有顯著貢獻(xiàn)。
圖 6
7. 邊緣癌區(qū)域比ST分析的中心癌區(qū)域更活躍為了進(jìn)一步了解scRNA-seq確定的四個癌癥亞群的空間分布和生物學(xué)意義，研究人員將癌癥區(qū)域重新聚集為亞區(qū)。AIS的TD8樣本，由中央?yún)^(qū)(黑色)和外圍區(qū)域(紅色)組成(圖7A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Clar-like癌細(xì)胞在外圍區(qū)域高度富集，中央?yún)^(qū)域以TM4SF1+癌細(xì)胞為主(圖7B)。Wnt/β-Catenin、血管生成通路等致癌信號在外圍區(qū)域高度(圖7D)。值得注意的是，與TGF-β信號通路相關(guān)的基因在中心區(qū)域高表達(dá)(圖7E），增殖指數(shù)在外圍區(qū)域高表達(dá)(圖7F)。在MIA中，區(qū)域的富集與AIS類似。但是富集途徑不同，EMT通路在外周區(qū)域2高度激活，而在中央?yún)^(qū)域0處于惰性狀態(tài)(圖7D)。最后，分析IAC樣本，中心區(qū)域和外圍區(qū)域都高度富集TM4SF1+癌細(xì)胞和UBE2C+癌細(xì)胞，特別是區(qū)域5，TGF-β信號通路相關(guān)的基因在癌區(qū)5高表達(dá)（圖7C-E）�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明UBE2C+癌細(xì)胞亞群在驅(qū)動AIS 到 MIA過程中起著至關(guān)重要的作用，癌細(xì)胞與TME之間的TGF-β信號相互作用以及調(diào)節(jié)免疫逃逸的空間變化與LUAD侵襲有關(guān)（圖 7G）。
圖 7
參考文獻(xiàn)：
Zhu J, Fan Y, Xiong Y, et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Exp Mol Med. 2022 Nov;54(11):2060-2076. doi: 10.1038/s12276-022-00896-9. Epub 2022 Nov 25. PMID: 36434043; PMCID: PMC9722784.
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