長(zhǎng)久以來，骨關(guān)節(jié)炎都是廣泛存在的關(guān)節(jié)退行性變，目前以軟骨為中心的OA發(fā)病機(jī)制觀點(diǎn)正轉(zhuǎn)向全關(guān)節(jié)模型。部分前沿研究顯示軟骨下骨退化是導(dǎo)致關(guān)節(jié)面覆蓋軟骨退化的重要觸發(fā)點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨負(fù)荷改變，隨后發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎。隨著研究不斷深入，不少結(jié)果提示毛細(xì)血管，尤其是H型血管與骨組織之間復(fù)雜的動(dòng)態(tài)交流是骨建模和骨重塑過程中必不可少的。同時(shí)有研究指出敲除PDGFR-β基因可以影響腫瘤細(xì)胞中的病理性血管生成。然而，在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中內(nèi)皮源PDGFR-β調(diào)節(jié)軟骨下H型血管的機(jī)制尚不清楚。

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科余斌團(tuán)隊(duì)在Bone Research發(fā)表了題為“Endothelial PDGF-BB/PDGFR-β signaling promotes osteoarthritis by enhancing angiogenesis-dependent abnormal subchondral bone formation”的文章。南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科余斌教授為通訊作者。南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科崔壯教授為該論文的第一作者。南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科為該研究提供了技術(shù)和平臺(tái)支持。該研究以前交叉韌帶切除手術(shù)（ACLT）誘導(dǎo)創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎小鼠這一模型為基礎(chǔ)，探索了PDGFR-β在骨關(guān)節(jié)炎中對(duì)H型血管的調(diào)節(jié)機(jī)制。
 

圖片來源：《Bone Research》
（https://www.nature.com/articles/s41413-022-00229-6）

研究材料
該實(shí)驗(yàn)使用了LoxP-flanked PDGFR-β（PDGFR-β^lox/lox）和Cdh5-Cre小鼠（均由賽業(yè)生物提供）。

研究方法
該實(shí)驗(yàn)首先使用了組織化學(xué)、免疫熒光和組織形態(tài)學(xué)，用蘇木精和伊紅(H&E)染色計(jì)算鈣化軟骨(CC)與透明組織厚度之比、采用Safranin O/Fast Green (SOFG)染色檢測(cè)軟骨中的蛋白聚糖、采用免疫染色對(duì)軟骨下骨的PDGFR-β, endomucin, CD31, nestin, lepR, MMP13, ATAMDTS, SOX9, Aggrecan, 和COL II抗體進(jìn)行了染色，并使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)使用了步態(tài)分析，馮·弗雷測(cè)試，流式細(xì)胞技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。

技術(shù)路線
01 骨關(guān)節(jié)炎中軟骨下骨與CD31 ^hiEmcn^hi ECs的PDGFR-β表達(dá)分析
02 構(gòu)建PDGFR-β基因敲除小鼠和細(xì)胞模型
03 PDGFR-β影響關(guān)節(jié)炎發(fā)病功能分析
04 PDGFR-β影響關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制分析
05 PDGFR-β/talin1/FAK復(fù)合物的模型建立
06 PDGFR-β/talin1/FAK復(fù)合物影響H型血管功能分析

研究結(jié)果

圖1 骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中，軟骨下骨的PDGFR-β表達(dá)升高[1]
 

該研究首先采用了前交叉韌帶切除手術(shù)（ACLT）誘導(dǎo)創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎小鼠與假手術(shù)小鼠對(duì)比，使用Westren Blot技術(shù)顯示出在OA患者的骨關(guān)節(jié)軟骨下骨PDGFR-β的表達(dá)量會(huì)顯著增加。其次使用了番紅染色、細(xì)胞免疫染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ACLT術(shù)后小鼠軟骨下骨的軟骨細(xì)胞量會(huì)減少且PDGFR-β表達(dá)顯著增加。
 

圖2 PDGFR-β在CD31 ^hiEmcn^hi ECs中高表達(dá)[1]

首先qRT-PCR技術(shù)對(duì)從骨髓中取出的CD31 ^hiEmcn^hi ECs和CD31 ^loEmcn^lo ECs中PDGFR-β進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示PDGFR-β在CD31 ^hiEmcn^hi ECs中表達(dá)較高。隨后通過FACS技術(shù)從OA術(shù)后4周、OA術(shù)后8周和空白組小鼠中分選軟骨下CD31 ^hiEmcn^hi ECs。再使用qRT-PCR、細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)，結(jié)果顯示骨關(guān)節(jié)炎小鼠的CD31 ^hiEmcn^hi ECs與PDGFR-β都會(huì)顯著升高。
 

圖3 PDGFR-β基因敲除小鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)程減緩[1]

為了探究骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程是不是與PDGFR-β有關(guān)，研究采用了LoxP-flanked PDGFR-β和Cdh5-Cre小鼠（由賽業(yè)生物提供）構(gòu)建PDGFR-β基因敲除小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證，使用SOFG染色、HE染色、免疫熒光染色技術(shù)，分別對(duì)OA術(shù)后4周和8周的PDGFR-β^-/-與PDGFR-β^lox/lox小鼠進(jìn)行染色，對(duì)比軟骨下骨化程度、軟骨退化程度和MMP13、Sox9、ADAMTS5、ColII、Aggrecan的顯影，結(jié)果表明PDGFR-β基因敲除小鼠的骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展進(jìn)程明顯減緩。
 

圖4 PDGFR-β^-/-小鼠軟骨下CD31 ^hiEmcn^hi ECs減少[1]
 

研究為了驗(yàn)證CD31 ^hiEmcn^hi ECs表達(dá)是否受到PDGFR-β影響，研究繼續(xù)在PDGFR-β基因敲除的小鼠中驗(yàn)證，首先通過FACS從不對(duì)條件處理的PDGFR-β^lox/lox和PDGFR-β^−/−小鼠中分離CD31 ^hiEmcn^hi ECs。再通過qRT-PCR和細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)，驗(yàn)證出敲除PDGFR-β后CD31 ^hiEmcn^hi ECs表達(dá)將減少。
 

圖5 PDGFR-β通過形成PDGFR-β/talin1/FAK復(fù)合物在體內(nèi)發(fā)揮作用[1]

為了探究現(xiàn)象背后的潛在機(jī)制，該研究使用了LC-MS/MS在BMEC中分析鑒定出了PDGFR-β結(jié)合蛋白FAK和TLN1。再通過免疫共沉淀技術(shù)確定了PDGFR-β與FAK、TLN1相結(jié)合。最后通過蛋白印跡技術(shù)，檢測(cè)PDGFR-BB或FAK抑制劑或TLN1 siRNA處理的BMEC中FAK、TLN1和VEGF表達(dá)情況。結(jié)果顯示PDGFR-BB可以激活PDGFR-β復(fù)合物并具有時(shí)間和劑量依賴性，而FAK抑制劑和TLN1都會(huì)抑制VEGFR表達(dá)。
 

圖6 PDGFR-β/talin1/FAK復(fù)合物促進(jìn)血管生成[1]

為了進(jìn)一步確認(rèn)PDGFR-β/talin1/FAK復(fù)合物在血管生成中起到的作用。通過攜帶PDGFR-β基因病毒轉(zhuǎn)染的方式，超表達(dá)和抑制PDGFR-β。使用ELISA技術(shù)確認(rèn)VEGF在不同病毒轉(zhuǎn)染的BMECs的表達(dá)情況，在試管形成實(shí)驗(yàn)中設(shè)置PDGFR-β過表達(dá)組、PDGFR-β抑制組、talin1抑制組和FAK抑制組研究BMECs的總回路、總分支點(diǎn)和總長(zhǎng)度。再通過CCK-8和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)以上條件下BMECs的增殖和運(yùn)動(dòng)量化分析。結(jié)果表明PDGFR-β通過與talin1、FAK形成復(fù)合物的形式來促進(jìn)血管的生成。
 

圖7 內(nèi)源性PDGFR-β可以抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程[1]

為了探索內(nèi)源性PDGFR-β對(duì)于OA的影響，通過注射AAV9抑制內(nèi)源性PDGFR-β在ACLT處理后小鼠的表達(dá)。使用免疫熒光技術(shù)對(duì)endomucin，CD31和LepR或Nestin染色，結(jié)果顯示抑制PDGFR-β可以緩解ACLT術(shù)后小鼠關(guān)節(jié)炎病程。同時(shí)可以使OA小鼠骨小梁模式因子、軟骨下骨骨板厚度、骨量/總組織體積和小梁骨數(shù)情況逆轉(zhuǎn)趨向正常。并且研究通過SOFG染色技術(shù)顯示出抑制PDGFR-β可以減緩軟骨的降解。

研究結(jié)論
綜上，目前的研究顯示，研究者發(fā)現(xiàn)PDGFR-β在OA患者、老年小鼠和創(chuàng)傷性O(shè)A小鼠的軟骨下骨中顯著升高，并且PDGFR-β主要在軟骨下骨中的CD31 ^hiEmcn^hi ECs表達(dá)。值得關(guān)注的是，在軟骨下骨局部注射AAV9抑制內(nèi)源性特異性PDGFR-β后，異常的基于H型血管的骨形成和骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程都緩解了。除此之外，該研究還發(fā)現(xiàn)了在PDGFR-β基因敲除小鼠的PDGFR-β會(huì)在ACLT術(shù)后4周后開始升高，這表明ACLT后升高的PDGFR-β可能有其他來源如周皮細(xì)胞。作者認(rèn)為在OA的刺激下，軟骨下單核破骨細(xì)胞前體釋放出大量的PDGFR-BB，與CD31 ^hiEmcn^hi ECs與周皮細(xì)胞上的PDGFR-β相結(jié)合，促進(jìn)了周皮細(xì)胞向CD31 ^hiEmcn^hi ECs募集，共同促進(jìn)了在骨關(guān)節(jié)炎中基于異常H型血管的軟骨下骨形成。

總而言之，PDGFR-β通過PDGFR-β/talin1/FAK通路促進(jìn)H型血管的形成并導(dǎo)致異常的骨形成，并且抑制PDGFR-β或使其失去功能可以緩解骨關(guān)節(jié)炎的病程，此外，研究提供了在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中內(nèi)源性PDGFR-β調(diào)節(jié)血管形成與骨形成的機(jī)制。因此，PDGFR-β被確定成為了骨關(guān)節(jié)炎潛在有效的新靶點(diǎn)。

原文檢索：
[1]Cui Z, Wu H, Xiao Y, Xu T, Jia J, Lin H, Lin R, Chen K, Lin Y, Li K, Wu X, Li C, Yu B. Endothelial PDGF-BB/PDGFR-β signaling promotes osteoarthritis by enhancing angiogenesis-dependent abnormal subchondral bone formation. Bone Res. 2022 Aug 29;10(1):58. doi: 10.1038/s41413-022-00229-6. PMID: 36031625; PMCID: PMC9420732.