小細(xì)胞外囊泡 (small extracellular vesicles, sEVs) 是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，通過各種生物工程方法可以發(fā)揮它在治療方面的作用。多能干細(xì)胞 (pluripotent stem cells, PSC) 來源的sEVs作為一種潛在的再生醫(yī)學(xué)療法，在多種與衰老相關(guān)的退行性疾病中表現(xiàn)出巨大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。針對當(dāng)前人口老齡化嚴(yán)重的現(xiàn)狀，PSC-sEVs具有十分廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，由于PSC-sEVs特異性表征手段的缺乏，阻礙了PSC-sEVs由基礎(chǔ)研究向工業(yè)化轉(zhuǎn)化的應(yīng)用。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院汪泱/李青教授團(tuán)隊(duì)在國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會 (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) 官方權(quán)威期刊《Journal of Extracellular Vesicles》發(fā)表了題為“Identification of specific markers for human pluripotent stem cell-derived small extracellular vesicles”的研究論文。該研究基于蛋白組學(xué)和納米流式分析技術(shù)，首次鑒定了一組PSC-sEVs特異性的蛋白標(biāo)志物，為PSC-sEVs的標(biāo)準(zhǔn)化鑒定和質(zhì)量控制提供了新的視角和強(qiáng)有力的手段。
 

01 PSC-sEV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析及驗(yàn)證
胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cells, ESCs) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cells, iPSCs) 均屬于PSCs。首先，該研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析分別對iPSC-sEVs和ESC-sEVs的蛋白組成進(jìn)行了鑒定。如圖1所示，作者在鑒定到的5000多種蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)和選擇了7種高度富集的多能性相關(guān)蛋白，并結(jié)合Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示（圖1g）其中六種蛋白 (PODXL、YB1、IFITM1、LIN28A、OCT4和Dnmt3A) 在不同多能干細(xì)胞來源的EVs中均明顯富集，具有作為多能干細(xì)胞sEVs標(biāo)志物的潛力。
 

圖1.PSC-sEVs的蛋白質(zhì)組分析

作者進(jìn)一步對這些蛋白在 PSC-sEVs中的特異性表達(dá)進(jìn)行了探究。通過對七種非多能干細(xì)胞 (293T、HFF1、huMSC、A549、H460、MCF7、MDA-MB-231) 來源的 sEVs進(jìn)行分析，Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)LIN28A、OCT4、Dnmt3a在7種非PSC-EVs中不表達(dá)，YB1和IFITM1在4種非PSC-EVs中可檢測到。PODXL在MCF7-sEVs和MDA-MB-231-sEVs中均有檢測到，但條帶出現(xiàn)在與PSC-sEV 條帶不同的位置，PODXL也可用于有效區(qū)分PSC-sEVs與非PSC-sEVs。因此，這四種蛋白 (PODXL、OCT4、Dnmt3a、LIN28A) 被認(rèn)為可用于PSC-sEVs的特異性鑒定和質(zhì)量控制。

02 單PSC-sEV水平特異性標(biāo)志物分析
由于EVs的高度異質(zhì)性，作者采用納米流式檢測技術(shù) (nano-flow cytometry, NanoFCM) 在單囊泡水平對標(biāo)志物表達(dá)的特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。作者以PSC和7種非PSC細(xì)胞來源的EVs為研究模型，考察了3種傳統(tǒng)標(biāo)志物 (CD9、CD63和CD81) 、膜蛋白PODXL和表面糖脂SSEA4的表達(dá)情況。如圖2所示，這些表面標(biāo)志物在不同細(xì)胞系來源sEVs的表達(dá)具有極強(qiáng)的異質(zhì)性。CD9蛋白在的PSC-sEVs中陽性率可達(dá)到60%以上，而CD63和CD81的陽性率在PSC-sEVs與非PSC-sEVs之間沒有顯著差異。對于PSC-sEVs的特異性標(biāo)志物PODXL和SSEA4在PSC-sEVs中的陽性率分別為50%和70%以上，而在非PSC-sEVs中陽性率僅在1%到18%之間，遠(yuǎn)低于PSC-sEVs的表達(dá)比例。作者進(jìn)一步利用熒光共聚焦顯微鏡對PODXL和SSEA4在sEVs上的表達(dá)情況進(jìn)行了觀測，其結(jié)果顯示大多數(shù)PSC-sEVs呈現(xiàn)PODXL或SSEA4呈陽性，該結(jié)果與NanoFCM檢測結(jié)果相吻合。綜上，單囊泡水平的檢測分析進(jìn)一步印證了PODXL和SSEA4可作為PSC-sEVs特異性標(biāo)志物。
 

圖2. 不同細(xì)胞來源sEVs的多種表面標(biāo)志物的NanoFCM檢測分析

03 密度梯度離心（DGUC）純化后的PSC-sEVs標(biāo)志物驗(yàn)證
由于基于超速離心的純化所得的EVs樣本中可能存在非囊泡組分的污染，作者進(jìn)一步對樣品進(jìn)行密度梯度離心純化。如圖3所示，PODXL、OCT4、Dnmt3a和LIN28A蛋白同樣在經(jīng)由DGUC所得EVs樣本中被大量富集，該結(jié)果也證明了這些標(biāo)志蛋白并非來自污染物。此外，NanoFCM分析結(jié)果也進(jìn)一步表明DGUC純化所得sEVs的CD9、CD63、CD81、PODXL和SSEA4的陽性率均與UC所得EVs相似（圖3e-j），進(jìn)一步排除了所鑒定的標(biāo)志物來自污染物的可能性，以及不同純化方法導(dǎo)致的標(biāo)志物差異的問題。
 

圖3.DGUC純化后sEVs樣品分析

綜上所述，該研究首次鑒定了一組 PSC-sEV 的特異性標(biāo)志物，含PODXL、OCT4、Dnmt3a、 LIN28A、和SSEA4。這些標(biāo)志物可用于PSC-sEVs的鑒定和質(zhì)量控制，對于PSC-sEVs的臨床應(yīng)用極具價(jià)值。

NanoFCM展望
基于干細(xì)胞EVs療法在疾病治療領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，NanoFCM憑借其卓越的散射和熒光檢測性能，在單顆粒外泌體水平實(shí)現(xiàn)了不同豐度的蛋白標(biāo)志物分析，助力干細(xì)胞EVs特異性標(biāo)志物表征，為干細(xì)胞EVs療法帶來新的見解和策略，將大大縮短分析時(shí)間，極大加快了干細(xì)胞EVs療法的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

同時(shí)，隨著我司在納米流式上下游解決方案的不斷升級，目前我們已經(jīng)發(fā)布了膜內(nèi)蛋白檢測方案（往期文章：NanoPC & 膜通透劑，內(nèi)腔蛋白表征一站式方案�。�有望用一臺儀器，同時(shí)解決以上膜內(nèi)外不同標(biāo)志蛋白的鑒定工作，感興趣的老師，可聯(lián)系我司客服獲取方案。此外，本文用到的熒光抗體試劑如：AF488-CD9,AF488-CD63,FITC-CD81（如下圖4所示），均購自廈門福流 (NanoFCM Inc.) 感興趣的老師，可掃描下方客服二維碼聯(lián)系我司。
 

圖4.sEVs的免疫熒光染色