MeRIP-seq揭示lncRNA甲基化通過蛋白質軸抑制胃癌干細胞凋亡
癌癥一直是生物學研究的熱門話題。關于癌癥起源，一種主流觀點是癌癥干細胞（Cancer Stem Cell，CSC）的無限增殖。CSC是腫瘤內腫瘤細胞的一個亞類，具有自我更新和異常分化能力。CSC不僅調控腫瘤的發(fā)生、傳播和維持，還有助于腫瘤的化療耐藥性和復發(fā)。因此迫切需要探索影響生物活性的因素，特別是CSC分化。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為基因表達的調控因子，在CSCs的細胞活性中起著關鍵作用。然而RNA（特別是lncRNA）的表觀遺傳調控機制尚未得到廣泛探索。
N6-甲基腺苷（m6A）可逆修飾在轉錄后和翻譯調控中起著至關重要的作用。m6A修飾對干細胞和癌癥干細胞的干性維持和分化具有顯著影響。但lncRNA的m6A修飾及其對CSC的影響仍未探索。
浙江大學生命科學學院章曉波教授團隊對胃癌（GC）患者中分離的胃癌干細胞（GCSCs）和胃癌非干細胞（GCNSCs）的lncRNA m6A修飾差異進行表征，揭示了位點特異性lncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG m6A修飾通過增加miRNAs和蛋白質的穩(wěn)定性，抑制凋亡和促進增殖，從而促進GCSCs的腫瘤發(fā)生。相關研究成果以“Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis”為題發(fā)表在《Cellular & Molecular Biology Letters》雜志。
標題：Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis（甲基化的lncRNA通過lncRNA-miRNA/蛋白軸抑制胃癌干細胞的凋亡）
時間：2024.4.10
期刊：Cellular & Molecular Biology Letters
影響因子：IF 8.3 / 1區(qū)
實驗方法：MeRIP-seq、MeRIP-qPCR等
研究摘要：
背景：長鏈非編碼RNA（lncRNA）在胃癌的腫瘤發(fā)生中起著至關重要的作用。然而，lncRNA甲基化對胃癌干細胞（GCSC）的影響尚不清楚。
目的：探究lncRNA甲基化在GCSCs中的作用及其對胃癌發(fā)生的貢獻。
方法：
2. 通過基于單堿基延伸和連接的qPCR擴增（SELECT）檢測lncRNA上m6A特異性修飾位點。
3. 構建并轉染與催化失活的Cas13（dCas13b）融合蛋白的表達甲基轉移酶樣3（METTL3）質粒，并誘導靶向lncRNA特異性甲基化位點的RNA，獲得具有l(wèi)ncRNAs位點特異性甲基化的胃癌干細胞。
4. 使用逆轉錄(RT)-qPCR和Western blot分析處理后的胃癌干細胞的細胞干性（stemness）。
結果：
PSMA3-AS1和MIR22HG的位點特異性甲基化抑制了GCSCs的細胞凋亡并促進其細胞干性。
LncRNA甲基化增強了PSMA3-AS1和MIR22HG的穩(wěn)定性，通過PSMA3-AS1–miR-411-3p–或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1軸抑制GCSC的凋亡。
甲基化的lncRNAs促進了PSMA3-AS1與EEF1A1蛋白或MIR22HG與LRPPRC蛋白之間的相互作用，穩(wěn)定了蛋白并抑制細胞凋亡。
體內數(shù)據(jù)顯示，甲基化的PSMA3-AS1和MIR22HG觸發(fā)了GCSCs的腫瘤發(fā)生。
結論：
本研究揭示了lncRNAs位點特異性甲基化在GCSCs腫瘤發(fā)生中的必要性，為癌癥發(fā)展提供了新的見解。
結果圖形：
（1）GCSC中的lncRNA m6A甲基化
圖1：GCSC中的N6-甲基腺苷lncRNA。
A. GCSC和GCNSC腫瘤球形成百分比。
B. GCSC的單個細胞的腫瘤球形成分析。
C. 用Western blot檢測GCSCs和GCNSCs中干性基因的表達。
D. GCSC遷移的效率。對GCSC和GCNSC進行Transwell遷移測定以檢查細胞遷移。
E. GCSC的化學抗性。用不同濃度的順鉑處理GCSC或GCNSC。處理后48小時，對細胞進行細胞活力測定（**p<0.01）。計算半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值。
F. GCSC和GNCSC中RNA的m6A修飾。
G. GCSC和GNCSC中差異表達的m6A修飾 lncRNA熱圖。
H. 甲基化lncRNAs在GCNSCs和GCSCs中的表達譜。**p<0.01
（2）GCSCs中的lncRNA甲基化機制
圖2：GCSC中的lncRNA甲基化機制。
A. 從HGC-27（GCSC-HGC）和MGC-803（GCSC-MGC）分選的GCSC單個細胞的腫瘤球形成測定。
B. GCSC-HGC和GCSC-MGC中干性基因的Western blot分析。
C. GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的遷移能力。用Transwell遷移測定法分析GCSC-HGC、GCNSC-HGC、GCSC-MGC和GCNSC-MGC以檢查細胞遷移。遷移細胞的代表性圖像顯示在左側。遷移細胞的百分比顯示在右側（**p<0.01）。
D. GCSC（GCSC-HGC和GCSC-MGC）的化學抗性效率。用不同濃度的順鉑處理GCSC或GCNSC。處理后48小時，用細胞活力測定（**，p < 0.01）。計算半數(shù)最大抑制濃度（IC50）值。
E. 檢查GCSC中甲基轉移酶METTL3和METTL14的表達。
F. 用METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救GCSC中METTL3的Western blot。
G. 具有METTL3 shRNA或METTL3 shRNA拯救的GCSC中l(wèi)ncRNA的m6A水平。
H. 使用Western blot檢測METTL3沉默或拯救的GCSC中干性基因的表達。β-tubulin蛋白用作對照。
I. METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救GCSC中METTL14的Western blot。
J. 使用METTL14 shRNA或METTL14 shRNA拯救的GCSC中l(wèi)ncRNA的m6A水平。
K. 通過Western blot檢測METTL14沉默或拯救的GCSC中干性基因的表達。**p<0.01
（3）甲基化lncRNAs在GCSCs中的作用
圖3：甲基化lncRNA在GCSC中的作用。
A. GCSC中六種lncRNA（PAPPA-AS1、PSMA3-AS1、MIR22HG、LINC00342、LINC01410和LINC00680）的表達譜。
B. 驗證GCSC中l(wèi)ncRNA沉默。
C. 用lncRNAs siRNA檢測GCSCs中干細胞基因的表達。
D. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSCs的細胞活力。
E. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC的細胞周期分析。
F. 用于PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC的Caspase-3/7檢測。
G. 預測lncRNA的甲基化位點。
H. GCSC和GCNSC之間lncRNA的m6A水平。
I. METTL3沉默的GCSC的m6A水平與lncRNA的位點特異性甲基化。
J. 具有l(wèi)ncRNA位點特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的細胞活力。
K. 具有l(wèi)ncRNA位點特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的細胞周期分析。
L. 用于METTL3沉默的GCSC的Caspase-3/7檢測，其具有l(wèi)ncRNA的位點特異性甲基化。
M. Western blot檢測METTL3沉默的GCSCs的干細胞基因與lncRNAs的位點特異性甲基化。
N. lncRNA位點特異性甲基化的METTL3沉默的GCSC的腫瘤球形成百分比。
O. 用甲基化的lncRNA對METTL3沉默的GCSC的單細胞進行腫瘤球形成檢測。**p<0.01
（4）m6A修飾對lncRNAs穩(wěn)定性的影響
圖4：m6A修飾對lncRNA穩(wěn)定性的影響。
A. METTL3沉默的GCSC中l(wèi)ncRNA PSMA3-AS1和MIR22HG的相對表達水平。
B. 用放線菌素D處理METTL3沉默的GCSCs的lncRNAs穩(wěn)定性。
（5）lncRNAs在GCSCs中的潛在機制
圖5：GCSC中l(wèi)ncRNA的潛在機制。
A. GCSC中的lncRNA-miRNA互作的相對富集。
B. 雙熒光素酶報告基因檢測GCSC中潛在的miRNA-lncRNA互作。
C. miR-411-3p和miR-24-3p在GCSCs和GCNSCs中的表達譜。
D. 使用microT、miRmap和TargetScan預測miRNA的潛在靶基因。
E. 驗證GCSC中miRNA的過表達。
F. 檢測miRNA過表達的GCSC中靶基因表達水平。
G. 通過雙熒光素酶報告基因測定驗證miRNA與靶基因的互作。
H. GCSCs和GCNSCs中miRNA靶基因的表達水平。
I. GCSC和GCNSC中miRNA靶基因的Western Blot。
J. 用于AP1G1或SERTAD1沉默GCSC的Caspase-3/7檢測。
K. Western Blot分析AP1G1或SERTAD1沉默GCSC中的干性基因。
L. PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中AP1G1或SERTAD1的表達水平。
M. Western Blot分析PSMA3-AS1或MIR22HG沉默的GCSC中miRNA的靶基因。**p<0.01
（6）m6A修飾的lncRNA與蛋白質互作
圖6：m6A修飾的lncRNA與蛋白質互作。
A. 用于lncRNA下拉分析的SDS-PAGE。箭頭表示鑒定出的蛋白質。M：protein marker。
B. 與lncRNA結合的蛋白質Western Blot分析。
C. 檢測PSMA3-AS1或MIR22HG沉默GCSC中與lncRNA結合的蛋白質穩(wěn)定性。
D. GCSC中EEF1A1和LRPPRC的mRNA和蛋白質水平。
E. 通過RT-qPCR和Western Blot分析驗證GCSC中EEF1A1或LRPPRC的沉默。
F. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的細胞活力。
G. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的細胞周期分析。
H. EEF1A1或LRPPRC沉默GCSC的Caspase-3/7檢測。
I. Western blot分析EEF1A1或LRPPRC沉默GCSCs的干性基因。**p<0.01
（7）lncRNAs m6A修飾對GCSCs體內腫瘤發(fā)生的影響
圖7：lncRNA的m6A修飾對體內GCSC腫瘤發(fā)生的影響。
A. 具有l(wèi)ncRNA甲基化GCSC的模型小鼠示意圖。
B. 單獨注射METTL3沉默的GCSC（對照）或用甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG注射METTL3沉默的GCSC的異種移植小鼠腫瘤體積。
C. 單獨使用METTL3沉默的GCSC（對照）或甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的METTL3沉默的GCSC的小鼠實體瘤大小。
D. 單獨使用METTL3沉默的GCSC（對照）或METTL3沉默的GCSC與甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠實體瘤重量。
E. 單獨注射METTL3沉默的GCSC（對照）或METTL3沉默的GCSC與甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠實體瘤lncRNA m6A水平。
F. 免疫組化分析Ki67和Caspase 3在單獨注射METTL3沉默GCSC（對照）或METTL3沉默的GCSC與甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG的小鼠實體瘤表達。
G. western blot分析經(jīng)甲基化PSMA3-AS1或MIR22HG處理的小鼠實體瘤中干性基因表達。
H. 甲基化PSMA3-AS1和MIR22HG在GCSC中的作用模型。**p<0.01
研究小結：
本研究結果表明，由METTL3和METTL14介導的PSMA3-AS1和MIR22HG甲基化水平在GCSC中顯著增加。研究揭示了PSMA3-AS1和MIR22HG的位點特異性m6A修飾抑制了細胞凋亡并促進GCSC干性。LncRNA甲基化增加了PSMA3-AS1和MIR22HG的穩(wěn)定性，通過PSMA3-AS1–miR-411-3p–AP1G1或MIR22HG–miR-24-3p–SERTAD1軸促進GCSC增殖并抑制其凋亡。同時PSMA3-AS1或MIR22HG甲基化促進了PSMA3-AS1與EEF1A1蛋白或MIR22HG與LRPPRC之間的互作并穩(wěn)定互作蛋白，從而抑制細胞凋亡并促進了GCSCs增殖。
參考文獻：
Ci Y, Zhang Y, Zhang X. Methylated lncRNAs suppress apoptosis of gastric cancer stem cells via the lncRNA-miRNA/protein axis. Cell Mol Biol Lett. 2024 Apr 10;29(1):51. pii: 10.1186/s11658-024-00568-8. doi: 10.1186/s11658-024-00568-8. PubMed PMID: 38600465.
