肝臟DNA甲基化分析揭示表觀遺傳衰老對(duì)異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的影響
65+歲的老年人發(fā)生藥物不良反應(yīng)（adverse drug reactions，ADR）的可能性是年輕人的7倍。隨著年齡增長(zhǎng)，生理變化會(huì)損害身體安全處理藥物的能力，從而影響ADR風(fēng)險(xiǎn)。這些變化包括肝血流量減少、止血儲(chǔ)備下降和身體成分改變，這些都可能影響藥物吸收、分布、代謝和排泄（absorption, distribution, metabolism, and excretion，ADME）過(guò)程。然而，這些生理變化發(fā)生的時(shí)間和程度存在很大的個(gè)體差異，藥物反應(yīng)與實(shí)際年齡沒(méi)有很好的相關(guān)性。因此，有必要更深入地了解影響ADME過(guò)程的與年齡相關(guān)的生理變化。
肝臟異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，而完整的異生素代謝與壽命有關(guān)。然而很少有研究分析表觀遺傳衰老對(duì)這些過(guò)程的全基因組范圍內(nèi)的影響。本文利用簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）繪制了4月齡和24月齡小鼠肝臟的DNA甲基化變化，鑒定出數(shù)千個(gè)年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（age-associated differentially methylated sites，a-DMS），其中許多位點(diǎn)與編碼I期和II期藥物代謝酶以及ABC和SLC類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因重疊。尤其Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2三個(gè)a-DMS顯著基因，分別編碼人類(lèi)藥物代謝酶Cyp1a2和CYP2D6以及多藥耐藥蛋白2（MRP2）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直系同源物。研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，Cyp2d9高甲基化與基因表達(dá)降低顯著相關(guān)，而Abcc2表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)沒(méi)有變化。Cyp1a2隨著年齡增長(zhǎng)而丟失甲基化，其表達(dá)也隨著年齡增長(zhǎng)而降低。研究還假設(shè)了年齡相關(guān)的低甲基化，但與年齡相關(guān)的肝臟轉(zhuǎn)錄機(jī)制失調(diào)導(dǎo)致基因下調(diào)。通過(guò)對(duì)樣品中低甲基化a-DMS進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明這些位點(diǎn)在肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）結(jié)合位點(diǎn)高度富集。HNF4α促進(jìn)Cyp1a2表達(dá)，并隨年齡增長(zhǎng)而下調(diào)，這可以解釋Cyp1a2表達(dá)的降低。總體而言，本研究支持表觀遺傳衰老對(duì)異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的廣泛影響。未來(lái)的工作應(yīng)該評(píng)估肝細(xì)胞核受體功能與表觀遺傳衰老之間的相互作用。這些結(jié)果可能對(duì)長(zhǎng)壽和健康衰老研究具有重要意義。
材料方法：
研究結(jié)果：
（1）測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、質(zhì)控和整體甲基化水平
本研究通過(guò)簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）技術(shù)，成功地對(duì)小鼠肝臟組織樣本進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)樣本平均產(chǎn)生32.9M序列read（范圍在25.1M~38.9M），這些reads與mm10基因組的比對(duì)情況良好，符合RRBS預(yù)期參數(shù)（平均比對(duì)率71.1%，范圍在68.6%~76.9%之間）。非CpG甲基化百分比在0.4%~0.8%之間，表明亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效果良好。CpG背景下胞嘧啶的整體甲基化平均水平在4月齡小鼠中為34.3%，而在24月齡小鼠中為33.6%，表明隨著年齡增長(zhǎng)，基因組整體呈現(xiàn)一定的低甲基化趨勢(shì)。
（2）年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn) （a-DMS） 的全基因組分析
通過(guò)RRBS DNA甲基化數(shù)據(jù)分析，研究人員利用主成分分析（PCA）對(duì)樣本進(jìn)行了降維處理，并根據(jù)相關(guān)性和Ward聚類(lèi)方法對(duì)樣本進(jìn)行了聚類(lèi)分析。圖1展示了樣本在前兩個(gè)主成分（PC1和PC2）上的載荷分布，而圖2則根據(jù)樣本間的相關(guān)性進(jìn)行了聚類(lèi)分析。
在圖1中，PC1和PC2能夠很好地區(qū)分年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠的樣本。表明盡管樣本之間存在一定的變異性，但年齡相關(guān)的甲基化模式在整體上可以區(qū)分。PC1和PC2的主成分分析結(jié)果揭示了樣本間甲基化水平的顯著差異，這些差異可能與年齡相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。
圖2中的聚類(lèi)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，通過(guò)Ward聚類(lèi)方法，樣本根據(jù)甲基化模式分為兩組，分別對(duì)應(yīng)于年輕和老年小鼠。聚類(lèi)結(jié)果表明，盡管存在個(gè)體差異，但年齡相關(guān)的甲基化變化在小鼠群體中是一致的，并且可以用來(lái)區(qū)分不同年齡的樣本。
這些結(jié)果表明，RRBS技術(shù)能夠有效地捕捉到與年齡相關(guān)的DNA甲基化變化，并且這些變化可以通過(guò)PCA和聚類(lèi)分析得到清晰的可視化。
圖1：基于相關(guān)性和Ward聚類(lèi)方法（來(lái)自MethyKit的分析），在RRBS DNA甲基化數(shù)據(jù)的前兩個(gè)主成分上繪制了樣本載荷圖，并對(duì)樣本進(jìn)行了B聚類(lèi)
圖2：4月齡和24月齡小鼠肝臟中與年齡相關(guān)的差異甲基化位點(diǎn)的火山圖。y軸是p值的負(fù)對(duì)數(shù)，x軸表示甲基化隨年齡的變化。全基因組顯著性由小于5%（水平虛線(xiàn)）的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）決定。垂直虛線(xiàn)顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，>10%高甲基化和 >10%低甲基化。全基因組顯著位點(diǎn)顯示隨著年齡增長(zhǎng)，＞10%高甲基化為紅色，>10%低甲基化為藍(lán)色。顯示了與前5個(gè)高甲基化和低甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因，以及頂級(jí)異生代謝基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
（3）與雌性小鼠中的a-DMS整合分析
表1：雄性小鼠肝臟中年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）與雌性小鼠肝臟中已發(fā)表的a-DMS重疊
（4）異生素代謝基因與顯著的a-DMS相關(guān)
圖3：年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）的基因本體論（GO）富集分析表明，＞10%的高甲基化或低甲基化基因涉及生物學(xué)過(guò)程。最豐富的生物學(xué)過(guò)程按照統(tǒng)計(jì)顯著性遞減的順序顯示。使用GREAT（Genomic Regions of Enrichment Annotation Tool）工具進(jìn)行分析和繪圖，揭示了與年齡相關(guān)的甲基化變化最顯著的基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。
（5）a-DMS與年齡相關(guān)的基因表達(dá)變化的整合
從獲得RRBS數(shù)據(jù)的相同生物材料中提取RNA，并使用qPCR檢測(cè)Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2的表達(dá)水平。
研究人員探討了Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2這三個(gè)基因隨著年齡增長(zhǎng)在DNA甲基化和表達(dá)水平上的變化。通過(guò)RRBS數(shù)據(jù)分析，研究顯示Cyp2d9基因隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)了甲基化水平增加（hypermethylation），而Cyp1a2和Abcc2則表現(xiàn)出甲基化水平降低（hypomethylation）。
在基因表達(dá)水平方面，與4月齡小鼠相比，Cyp2d9和Cyp1a2這兩個(gè)基因在24月齡小鼠中表達(dá)水平降低，而Abcc2基因的表達(dá)水平在年齡增長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有顯著差異。
此外，研究還分析了甲基化水平與基因表達(dá)之間的關(guān)系。Cyp2d9甲基化水平的增加與基因表達(dá)水平的降低之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明隨著年齡的增長(zhǎng)，Cyp2d9甲基化水平增加可能導(dǎo)致其表達(dá)水平的降低。然而，對(duì)于Cyp1a2和Abcc2，甲基化水平的變化與基因表達(dá)水平之間沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)。這可能意味著除了DNA甲基化之外，還有其他因素影響這些基因的表達(dá)。
圖4：Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化和表達(dá)隨年齡而變化。
A、D、G：三個(gè)位點(diǎn)DNA甲基化隨年齡變化最顯著，Cyp2d9隨著年齡增長(zhǎng)而顯示高甲基化，而Cyp1a2和Abcc2隨著年齡增長(zhǎng)而顯示低甲基化（來(lái)自RRBS的數(shù)據(jù)）。
B、E、H：RNA隨年齡變化的相對(duì)定量，其中4月齡小鼠樣本設(shè)置為平均值=1.0。隨著年齡增長(zhǎng)，兩種Cyp基因的基因表達(dá)均較低，而Abcc2表達(dá)隨年齡的增長(zhǎng)無(wú)顯著差異。
C、F、I：甲基化水平與基因表達(dá)之間的相關(guān)性。Cyp2d9的兩個(gè)變量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化變化與年齡和表達(dá)之間沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。（n=每個(gè)年齡組6只小鼠）
（6）結(jié)果的驗(yàn)證和重復(fù)
通過(guò)使用高分辨率熔解（HRM）技術(shù)分析亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA，研究人員對(duì)Cyp2d9和Cyp1a2基因隨年齡增長(zhǎng)在DNA甲基化和表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)。這些結(jié)果在一個(gè)獨(dú)立的雄性小鼠樣本集中得到了驗(yàn)證，每個(gè)年齡組（4月齡和24月齡）都有6只小鼠。
圖5：Cyp2d9和Cyp1a2的DNA甲基化和表達(dá)年齡相關(guān)變化的重復(fù)。
A、D：顯示了在一個(gè)獨(dú)立的雄性受試者樣本（每個(gè)年齡組n=6），使用靶向技術(shù)，對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行高分辨率熔解（HRM）分析。展示了在Cyp2d9和Cyp1a2基因的最顯著差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）上，隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA甲基化的變化情況。對(duì)于Cyp2d9，結(jié)果顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA甲基化水平增加，而對(duì)于Cyp1a2，甲基化水平則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。
B、E：分別顯示了重復(fù)樣品中Cyp2d9和Cyp1a2的基因表達(dá)隨年齡的變化。Cyp2d9隨著年齡的增長(zhǎng)，基因表達(dá)水平降低，這與甲基化水平增加有關(guān)。
C：Cyp2d9 DNA甲基化與表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，DNA甲基化增加導(dǎo)致表達(dá)減少。（每個(gè)年齡組n=12）。Cyp2d9的DNA甲基化和表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這意味著隨著甲基化水平的增加，Cyp2d9的表達(dá)水平降低。
F：在合并的發(fā)現(xiàn)和重復(fù)樣本中，Cyp1a2甲基化與表達(dá)水平之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，表明Cyp1a2基因的表達(dá)降低可能受到除DNA甲基化之外的其他因素的影響。
（7）DNA甲基化衰老對(duì)Cyp1a2表達(dá)的遠(yuǎn)端影響
研究人員探討了隨著年齡增長(zhǎng)，DNA甲基化衰老對(duì)Cyp1a2基因表達(dá)的遠(yuǎn)端效應(yīng)。研究人員提出了假設(shè)，即遠(yuǎn)端（長(zhǎng)遠(yuǎn)）高甲基化差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）可能會(huì)影響Cyp1a2表達(dá)降低。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員分析了整個(gè)基因組中所有a-DMS的甲基化水平與Cyp1a2表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。
通過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正（False Discovery Rate, FDR < 0.05），研究人員發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何a-DMS與Cyp1a2表達(dá)顯示出足夠強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。這意味著在他們的RRBS數(shù)據(jù)捕獲的任何位點(diǎn)上，遠(yuǎn)端a-DMS不太可能是導(dǎo)致Cyp1a2基因表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而降低的主要原因。
（8）低甲基化a-DMS的位點(diǎn)重疊分析
表2：低甲基化a-DMS肝臟轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的富集
參考文獻(xiàn)：
Abudahab S, Kronfol MM, Dozmorov MG, Campbell T, Jahr FM, Nguyen J, AlAzzeh O, Al Saeedy DY, Victor A, Lee S, Malay S, Lapato DM, Halquist MS, McRae M, Deshpande LS, Slattum PW, Price ET, McClay JL. Genome-wide analysis of hepatic DNA methylation reveals impact of epigenetic aging on xenobiotic metabolism and transport genes in an aged mouse model. Geroscience. 2024 Apr 1.
肝臟異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，而完整的異生素代謝與壽命有關(guān)。然而很少有研究分析表觀遺傳衰老對(duì)這些過(guò)程的全基因組范圍內(nèi)的影響。本文利用簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）繪制了4月齡和24月齡小鼠肝臟的DNA甲基化變化，鑒定出數(shù)千個(gè)年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（age-associated differentially methylated sites，a-DMS），其中許多位點(diǎn)與編碼I期和II期藥物代謝酶以及ABC和SLC類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因重疊。尤其Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2三個(gè)a-DMS顯著基因，分別編碼人類(lèi)藥物代謝酶Cyp1a2和CYP2D6以及多藥耐藥蛋白2（MRP2）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的直系同源物。研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，Cyp2d9高甲基化與基因表達(dá)降低顯著相關(guān)，而Abcc2表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)沒(méi)有變化。Cyp1a2隨著年齡增長(zhǎng)而丟失甲基化，其表達(dá)也隨著年齡增長(zhǎng)而降低。研究還假設(shè)了年齡相關(guān)的低甲基化，但與年齡相關(guān)的肝臟轉(zhuǎn)錄機(jī)制失調(diào)導(dǎo)致基因下調(diào)。通過(guò)對(duì)樣品中低甲基化a-DMS進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明這些位點(diǎn)在肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）結(jié)合位點(diǎn)高度富集。HNF4α促進(jìn)Cyp1a2表達(dá)，并隨年齡增長(zhǎng)而下調(diào)，這可以解釋Cyp1a2表達(dá)的降低。總體而言，本研究支持表觀遺傳衰老對(duì)異生素代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的廣泛影響。未來(lái)的工作應(yīng)該評(píng)估肝細(xì)胞核受體功能與表觀遺傳衰老之間的相互作用。這些結(jié)果可能對(duì)長(zhǎng)壽和健康衰老研究具有重要意義。
材料方法：
研究結(jié)果：（1）測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、質(zhì)控和整體甲基化水平
本研究通過(guò)簡(jiǎn)化基因組亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS）技術(shù)，成功地對(duì)小鼠肝臟組織樣本進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)樣本平均產(chǎn)生32.9M序列read（范圍在25.1M~38.9M），這些reads與mm10基因組的比對(duì)情況良好，符合RRBS預(yù)期參數(shù)（平均比對(duì)率71.1%，范圍在68.6%~76.9%之間）。非CpG甲基化百分比在0.4%~0.8%之間，表明亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效果良好。CpG背景下胞嘧啶的整體甲基化平均水平在4月齡小鼠中為34.3%，而在24月齡小鼠中為33.6%，表明隨著年齡增長(zhǎng)，基因組整體呈現(xiàn)一定的低甲基化趨勢(shì)。
（2）年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn) （a-DMS） 的全基因組分析
通過(guò)RRBS DNA甲基化數(shù)據(jù)分析，研究人員利用主成分分析（PCA）對(duì)樣本進(jìn)行了降維處理，并根據(jù)相關(guān)性和Ward聚類(lèi)方法對(duì)樣本進(jìn)行了聚類(lèi)分析。圖1展示了樣本在前兩個(gè)主成分（PC1和PC2）上的載荷分布，而圖2則根據(jù)樣本間的相關(guān)性進(jìn)行了聚類(lèi)分析。
在圖1中，PC1和PC2能夠很好地區(qū)分年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠的樣本。表明盡管樣本之間存在一定的變異性，但年齡相關(guān)的甲基化模式在整體上可以區(qū)分。PC1和PC2的主成分分析結(jié)果揭示了樣本間甲基化水平的顯著差異，這些差異可能與年齡相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程有關(guān)。
圖2中的聚類(lèi)分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，通過(guò)Ward聚類(lèi)方法，樣本根據(jù)甲基化模式分為兩組，分別對(duì)應(yīng)于年輕和老年小鼠。聚類(lèi)結(jié)果表明，盡管存在個(gè)體差異，但年齡相關(guān)的甲基化變化在小鼠群體中是一致的，并且可以用來(lái)區(qū)分不同年齡的樣本。
這些結(jié)果表明，RRBS技術(shù)能夠有效地捕捉到與年齡相關(guān)的DNA甲基化變化，并且這些變化可以通過(guò)PCA和聚類(lèi)分析得到清晰的可視化。
圖1：基于相關(guān)性和Ward聚類(lèi)方法（來(lái)自MethyKit的分析），在RRBS DNA甲基化數(shù)據(jù)的前兩個(gè)主成分上繪制了樣本載荷圖，并對(duì)樣本進(jìn)行了B聚類(lèi)
圖2：4月齡和24月齡小鼠肝臟中與年齡相關(guān)的差異甲基化位點(diǎn)的火山圖。y軸是p值的負(fù)對(duì)數(shù)，x軸表示甲基化隨年齡的變化。全基因組顯著性由小于5%（水平虛線(xiàn)）的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）決定。垂直虛線(xiàn)顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，>10%高甲基化和 >10%低甲基化。全基因組顯著位點(diǎn)顯示隨著年齡增長(zhǎng)，＞10%高甲基化為紅色，>10%低甲基化為藍(lán)色。顯示了與前5個(gè)高甲基化和低甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因，以及頂級(jí)異生代謝基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
（3）與雌性小鼠中的a-DMS整合分析
表1：雄性小鼠肝臟中年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）與雌性小鼠肝臟中已發(fā)表的a-DMS重疊（4）異生素代謝基因與顯著的a-DMS相關(guān)
圖3：年齡相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）的基因本體論（GO）富集分析表明，＞10%的高甲基化或低甲基化基因涉及生物學(xué)過(guò)程。最豐富的生物學(xué)過(guò)程按照統(tǒng)計(jì)顯著性遞減的順序顯示。使用GREAT（Genomic Regions of Enrichment Annotation Tool）工具進(jìn)行分析和繪圖，揭示了與年齡相關(guān)的甲基化變化最顯著的基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。（5）a-DMS與年齡相關(guān)的基因表達(dá)變化的整合
從獲得RRBS數(shù)據(jù)的相同生物材料中提取RNA，并使用qPCR檢測(cè)Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2的表達(dá)水平。
研究人員探討了Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2這三個(gè)基因隨著年齡增長(zhǎng)在DNA甲基化和表達(dá)水平上的變化。通過(guò)RRBS數(shù)據(jù)分析，研究顯示Cyp2d9基因隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)了甲基化水平增加（hypermethylation），而Cyp1a2和Abcc2則表現(xiàn)出甲基化水平降低（hypomethylation）。
在基因表達(dá)水平方面，與4月齡小鼠相比，Cyp2d9和Cyp1a2這兩個(gè)基因在24月齡小鼠中表達(dá)水平降低，而Abcc2基因的表達(dá)水平在年齡增長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有顯著差異。
此外，研究還分析了甲基化水平與基因表達(dá)之間的關(guān)系。Cyp2d9甲基化水平的增加與基因表達(dá)水平的降低之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明隨著年齡的增長(zhǎng)，Cyp2d9甲基化水平增加可能導(dǎo)致其表達(dá)水平的降低。然而，對(duì)于Cyp1a2和Abcc2，甲基化水平的變化與基因表達(dá)水平之間沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)。這可能意味著除了DNA甲基化之外，還有其他因素影響這些基因的表達(dá)。
圖4：Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化和表達(dá)隨年齡而變化。A、D、G：三個(gè)位點(diǎn)DNA甲基化隨年齡變化最顯著，Cyp2d9隨著年齡增長(zhǎng)而顯示高甲基化，而Cyp1a2和Abcc2隨著年齡增長(zhǎng)而顯示低甲基化（來(lái)自RRBS的數(shù)據(jù)）。
B、E、H：RNA隨年齡變化的相對(duì)定量，其中4月齡小鼠樣本設(shè)置為平均值=1.0。隨著年齡增長(zhǎng)，兩種Cyp基因的基因表達(dá)均較低，而Abcc2表達(dá)隨年齡的增長(zhǎng)無(wú)顯著差異。
C、F、I：甲基化水平與基因表達(dá)之間的相關(guān)性。Cyp2d9的兩個(gè)變量之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化變化與年齡和表達(dá)之間沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。（n=每個(gè)年齡組6只小鼠）
（6）結(jié)果的驗(yàn)證和重復(fù)
通過(guò)使用高分辨率熔解（HRM）技術(shù)分析亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA，研究人員對(duì)Cyp2d9和Cyp1a2基因隨年齡增長(zhǎng)在DNA甲基化和表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)。這些結(jié)果在一個(gè)獨(dú)立的雄性小鼠樣本集中得到了驗(yàn)證，每個(gè)年齡組（4月齡和24月齡）都有6只小鼠。
圖5：Cyp2d9和Cyp1a2的DNA甲基化和表達(dá)年齡相關(guān)變化的重復(fù)。
A、D：顯示了在一個(gè)獨(dú)立的雄性受試者樣本（每個(gè)年齡組n=6），使用靶向技術(shù)，對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA進(jìn)行高分辨率熔解（HRM）分析。展示了在Cyp2d9和Cyp1a2基因的最顯著差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）上，隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA甲基化的變化情況。對(duì)于Cyp2d9，結(jié)果顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，DNA甲基化水平增加，而對(duì)于Cyp1a2，甲基化水平則呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。
B、E：分別顯示了重復(fù)樣品中Cyp2d9和Cyp1a2的基因表達(dá)隨年齡的變化。Cyp2d9隨著年齡的增長(zhǎng)，基因表達(dá)水平降低，這與甲基化水平增加有關(guān)。
C：Cyp2d9 DNA甲基化與表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，DNA甲基化增加導(dǎo)致表達(dá)減少。（每個(gè)年齡組n=12）。Cyp2d9的DNA甲基化和表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這意味著隨著甲基化水平的增加，Cyp2d9的表達(dá)水平降低。
F：在合并的發(fā)現(xiàn)和重復(fù)樣本中，Cyp1a2甲基化與表達(dá)水平之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，表明Cyp1a2基因的表達(dá)降低可能受到除DNA甲基化之外的其他因素的影響。
（7）DNA甲基化衰老對(duì)Cyp1a2表達(dá)的遠(yuǎn)端影響
研究人員探討了隨著年齡增長(zhǎng)，DNA甲基化衰老對(duì)Cyp1a2基因表達(dá)的遠(yuǎn)端效應(yīng)。研究人員提出了假設(shè)，即遠(yuǎn)端（長(zhǎng)遠(yuǎn)）高甲基化差異甲基化位點(diǎn)（a-DMS）可能會(huì)影響Cyp1a2表達(dá)降低。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員分析了整個(gè)基因組中所有a-DMS的甲基化水平與Cyp1a2表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。
通過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正（False Discovery Rate, FDR < 0.05），研究人員發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何a-DMS與Cyp1a2表達(dá)顯示出足夠強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。這意味著在他們的RRBS數(shù)據(jù)捕獲的任何位點(diǎn)上，遠(yuǎn)端a-DMS不太可能是導(dǎo)致Cyp1a2基因表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而降低的主要原因。
（8）低甲基化a-DMS的位點(diǎn)重疊分析
表2：低甲基化a-DMS肝臟轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的富集參考文獻(xiàn)：
Abudahab S, Kronfol MM, Dozmorov MG, Campbell T, Jahr FM, Nguyen J, AlAzzeh O, Al Saeedy DY, Victor A, Lee S, Malay S, Lapato DM, Halquist MS, McRae M, Deshpande LS, Slattum PW, Price ET, McClay JL. Genome-wide analysis of hepatic DNA methylation reveals impact of epigenetic aging on xenobiotic metabolism and transport genes in an aged mouse model. Geroscience. 2024 Apr 1.
標(biāo)簽：
RRBS
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