帕金森�。≒D）是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，通常發(fā)生在老年人身上。它的主要特征是黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白聚集形成路易小體�；颊邥�(huì)出現(xiàn)一系列運(yùn)動(dòng)癥狀，包括震顫、肢體僵硬、動(dòng)作遲緩等。許多患者還會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能受損或癡呆。多巴胺替代療法和腦深部電刺激可以緩解運(yùn)動(dòng)癥狀，但無(wú)法延緩神經(jīng)變性。

鞘脂激活蛋白原（PSAP）是一種分泌型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，也是一種溶酶體蛋白，作為四種鞘脂激活蛋白的前體。之前的研究發(fā)現(xiàn)，PSAP的變異與帕金森病有關(guān)。這種蛋白的運(yùn)輸是通過(guò)與顆粒蛋白前體（PGRN）形成異源二聚體而實(shí)現(xiàn)的。PGRN也是一種溶酶體蛋白，水解后產(chǎn)生顆粒蛋白，而PGRN單倍劑量不足會(huì)導(dǎo)致額顳葉癡呆。

瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院和烏普薩拉大學(xué)的研究人員深入分析了PSAP和PGRN在帕金森病中的作用。研究者發(fā)現(xiàn)，PSAP可維持多巴胺能神經(jīng)元的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，并對(duì)抗實(shí)驗(yàn)性帕金森病。這項(xiàng)研究成果于2023年9月發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

圖片來(lái)源：《Nature Communications》
（https://doi.org/10.1038/s41467-023-41539-5）

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員采集了帕金森病患者及對(duì)照的大腦黑質(zhì)樣本、腦脊液及血漿樣本，委托賽業(yè)生物構(gòu)建了PSAP條件性敲除小鼠，將其與Cre工具鼠配繁獲得多巴胺能神經(jīng)元中的PSAP基因缺失的cPSAP^DAT小鼠。為了方便對(duì)比，研究者還構(gòu)建了cPSAP^SERT小鼠，其血清素神經(jīng)元中的PSAP基因缺失。研究者對(duì)實(shí)驗(yàn)中的小鼠和大鼠進(jìn)行了一系列行為測(cè)試，包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)、阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)等。研究者利用高效液相色譜（HPLC）分析了多種神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，并采用高通量的MALDI-MSI方法，對(duì)小鼠大腦開(kāi)展非靶向空間脂質(zhì)組分析。

技術(shù)路線
01 比較帕金森病患者及對(duì)照的大腦、血漿和腦脊液中的PSAP水平
02 構(gòu)建DA神經(jīng)元中PSAP基因缺失的cPSAP^DAT小鼠，評(píng)估多巴胺能標(biāo)志物和小鼠行為
03 通過(guò)MALDI-MSI方法評(píng)估cPSAP^DAT小鼠大腦中的脂質(zhì)成分變化
04 通過(guò)多巴胺能標(biāo)志物分析和小鼠行為測(cè)試，研究PSAP在α-syn毒性中的作用
05 評(píng)估通過(guò)AAV和封裝細(xì)胞遞送PSAP是否有治療帕金森病的潛力

研究結(jié)果
1.帕金森病患者大腦、血漿和腦脊液中的PSAP水平發(fā)生變化
首先，研究人員比較了帕金森病患者和對(duì)照的黑質(zhì)致密部（SNc）中多巴胺能神經(jīng)元的PSAP和PGRN水平。免疫熒光染色結(jié)果顯示，PSAP與PGRN共定位。重要的是，與對(duì)照組相比，帕金森病患者的多巴胺能神經(jīng)元（酪氨酸羥化酶TH陽(yáng)性）中的PSAP減少，而PGRN不變。之后，研究者又比較了患者和對(duì)照的腦脊液和血漿中的循環(huán)PSAP和PGRN水平。研究者發(fā)現(xiàn)，腦脊液和血漿PSAP均與帕金森病的運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)，而PGRN與非運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)。

2.cPSAP^DAT小鼠表現(xiàn)出多巴胺能標(biāo)志物的減少和行為缺陷
為了研究PSAP在多巴胺能系統(tǒng)中的作用，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了PSAP條件性敲除小鼠，將其與Cre工具鼠配繁獲得cPSAP^DAT小鼠，能夠特異性誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元中PSAP基因的缺失。通過(guò)高效液相色譜分析，研究者發(fā)現(xiàn)老齡cPSAP^DAT小鼠紋狀體、伏隔核和海馬體中的多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)明顯減少，包括多巴胺、高香草酸和3-甲氧基酪胺（圖1）。

為了進(jìn)行對(duì)比研究，研究人員還構(gòu)建了另一種小鼠品系cPSAP^SERT，其血清素神經(jīng)元中的PSAP基因缺失。與cPSAP^DAT小鼠不同，cPSAP^SERT小鼠海馬體中的5-羥色胺和5-羥基吲哚乙酸未檢測(cè)到變化（圖1）。對(duì)cPSAP^DAT小鼠進(jìn)行行為評(píng)估后，研究者發(fā)現(xiàn)8月齡和16月齡小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減退現(xiàn)象，4月齡小鼠和16月齡小鼠的姿勢(shì)控制和精細(xì)運(yùn)動(dòng)受損。同時(shí)，cPSAP^DAT小鼠還表現(xiàn)出焦慮和抑郁樣癥狀。相比之下，cPSAP^SERT小鼠在行為測(cè)試中并未表現(xiàn)出異常。
 

cPSAP^DAT小鼠表現(xiàn)出多巴胺能標(biāo)志物的減少和行為缺陷[1]

3.cPSAP^DAT小鼠大腦中的脂質(zhì)成分出現(xiàn)顯著差異
PSAP在溶酶體中被裂解為鞘脂激活蛋白（A-D），這些蛋白進(jìn)一步調(diào)節(jié)與溶酶體鞘脂相關(guān)的水解酶。考慮到鞘脂激活蛋白在許多糖鞘脂的代謝中起著重要作用，研究人員采用高通量的雙極性MALDI-MSI方法，對(duì)cPSAP^DAT和對(duì)照小鼠的大腦開(kāi)展非靶向空間脂質(zhì)組分析。結(jié)果顯示，4月齡、8月齡和16月齡cPSAP^DAT小鼠和對(duì)照小鼠大腦中的脂質(zhì)成分存在顯著差異（圖2）。

具體來(lái)說(shuō)，在16月齡cPSAP^DAT小鼠的大腦中，高度不飽和心磷脂（CL）增加，低度不飽和CL減少；長(zhǎng)鏈CL增加，短鏈CL減少。磷脂酰膽堿（PC）也出現(xiàn)類似的變化模式。第一種模式表明脂肪酸的去飽和化作用過(guò)強(qiáng)，而第二種模式則表明過(guò)氧化物酶體β-氧化作用過(guò)強(qiáng)。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，cPSAP^DAT小鼠大腦中的鞘脂類普遍減少，比如棕櫚酸肉堿和鞘磷脂類。相比之下，cPSAP^SERT小鼠大腦中的脂質(zhì)成分與對(duì)照組相比沒(méi)有幾乎沒(méi)有差異（圖2）。這些結(jié)果表明，PSAP可維持多巴胺能神經(jīng)元的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。
 

cPSAP^DAT小鼠大腦中的高度不飽和脂類和短鏈脂類增加[1]

4.cPSAP^DAT小鼠對(duì)α-syn誘導(dǎo)的多巴胺能變性更敏感
越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，脂類對(duì)α-突觸核蛋白（α-syn）的聚集和神經(jīng)毒性及路易小體的形成起著至關(guān)重要的作用。最近有報(bào)道稱，不飽和脂肪酸會(huì)增加α-syn的毒性。為此，研究人員分析了PSAP在α-syn毒性中的作用。研究者在4月齡cPSAP^DAT小鼠和野生型對(duì)照小鼠的單側(cè)黑質(zhì)內(nèi)注射AAV-α-syn或AAV-GFP，部分小鼠同時(shí)注射AAV-PSAP。旋轉(zhuǎn)測(cè)試表明，當(dāng)α-syn過(guò)表達(dá)時(shí)，cPSAP^DAT小鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)比WT小鼠多。不過(guò)，通過(guò)注射AAV-PSAP來(lái)補(bǔ)充PASP可以防止AAV-α-syn對(duì)cPSAP^DAT小鼠旋轉(zhuǎn)行為的惡化作用。

免疫組化分析結(jié)果表明，在兩種小鼠中，α-syn過(guò)表達(dá)都會(huì)降低同側(cè)紋狀體中的酪氨酸羥化酶，不過(guò)它在cPSAP^DAT小鼠中造成的紋狀體和黑質(zhì)酪氨酸羥化酶丟失比WT小鼠明顯得多，表明cPSAP^DAT小鼠對(duì)α-syn誘導(dǎo)的多巴胺能變性更敏感。與行為學(xué)數(shù)據(jù)一致的是，PSAP的過(guò)表達(dá)顯著恢復(fù)了紋狀體和黑質(zhì)的酪氨酸羥化酶。磷酸化的α-syn Ser129（p-Ser129 α-syn）被認(rèn)為是α-syn的病理形式，容易聚集。研究人員發(fā)現(xiàn)，在cPSAP^DAT小鼠中，α-syn過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致p-Ser129 α-syn顯著聚集，而PSAP的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。

5.PSAP的生物遞送可防止α-syn誘導(dǎo)的大鼠多巴胺能神經(jīng)元丟失
此外，研究人員還分析了通過(guò)AAV過(guò)表達(dá)PSAP是否能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。在6-OHDA誘導(dǎo)紋狀體病變前六周，研究者在WT小鼠同側(cè)黑質(zhì)致密部?jī)?nèi)注射AAV-PSAP或AAV-GFP。注射AAV-PSAP的小鼠向?qū)��?cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)明顯少于對(duì)照小鼠，表明PSAP的過(guò)表達(dá)保護(hù)了紋狀體多巴胺能神經(jīng)元免受6-OHDA損傷。

考慮到PSAP和PGRN都是分泌蛋白，可被cPSAP^DAT小鼠的多巴胺能神經(jīng)元所吸收，故研究人員考慮采用封裝細(xì)胞（ECB）來(lái)遞送PSAP，以此來(lái)抵消α-syn誘導(dǎo)的毒性。研究者將PSAP單側(cè)遞送至同側(cè)半球已注射AAV-α-syn的大鼠的紋狀體（圖3）。研究者在2周、8周和12周開(kāi)展曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，并在12周進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)序，以評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)行為。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不使用封裝細(xì)胞遞送裝置的大鼠會(huì)出現(xiàn)α-syn誘導(dǎo)的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)減退，而遞送了PSAP或PSAP-PGRN的大鼠則表現(xiàn)出完整的運(yùn)動(dòng)能力。在旋轉(zhuǎn)測(cè)試中，ECB-PSAP大鼠向?qū)��?cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)明顯少于無(wú)裝置大鼠和ECB-PGRN大鼠，這進(jìn)一步證明了PSAP對(duì)α-syn誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)失調(diào)具有保護(hù)作用。
 

PSAP的封裝細(xì)胞遞送可防止α-syn誘導(dǎo)的大鼠帕金森病[1]

研究結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究表明，PSAP在多巴胺能神經(jīng)元的生理穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，尤其是在脂質(zhì)代謝中。多巴胺能神經(jīng)元中PSAP的缺失會(huì)增加小鼠對(duì)α-syn過(guò)表達(dá)的脆弱性。值得注意的是，黑質(zhì)內(nèi)注射AAV-PSAP可挽救α-syn誘導(dǎo)的帕金森病。此外，采用封裝細(xì)胞向紋狀體內(nèi)遞送PSAP也能夠治療α-syn誘導(dǎo)的帕金森病。因此，PSAP是帕金森病發(fā)病機(jī)制的一種潛在調(diào)節(jié)因子，補(bǔ)充PSAP可能有助于阻止帕金森病進(jìn)展。

原文檢索
[1]He, Y., Kaya, I., Shariatgorji, R. et al. Prosaposin maintains lipid homeostasis in dopamine neurons and counteracts experimental parkinsonism in rodents. Nat Commun 14, 5804 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41539-5
 

PSAP KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Psap^em1/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：
S-KO-17634
應(yīng)用方向：
癌癥,代謝,免疫,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見(jiàn)病
 

PSAP flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Psap^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：
S-CKO-18398
應(yīng)用方向：
癌癥,代謝,免疫,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見(jiàn)病