肥厚型心肌�。╤ypertrophic cardiomyopathy, HCM）是最常見的遺傳性心肌病，發(fā)病率約為1/500，HCM以左心室不對稱增厚和舒張功能受損為特征，是心力衰竭和心源性猝死的主要原因。目前仍有很大比例HCM患者（56.10%）未確定致病基因。因此，發(fā)現(xiàn)新的致病基因?yàn)榻沂綡CM發(fā)病機(jī)制及診斷治療具有重要意義。
 

圖片來源：《Circulation》
（https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064489）

2月16日，空軍軍醫(yī)大學(xué)吳元明教授團(tuán)隊(duì)在心血管領(lǐng)域頂尖雜志《Circulation》（IF 37.8）上發(fā)表題為“FARS2 Deficiency Causes Cardiomyopathy by Disrupting Mitochondrial Homeostasis and the Mitochondrial Quality Control System”的研究論文，該研究通過分析一例HCM患者家系和1141名HCM患者人群數(shù)據(jù)，鑒定得到了一個導(dǎo)致HCM的新致病基因——FARS2，通過建立多種FARS2基因缺陷動物和細(xì)胞模型，明確FARS2缺陷會直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心肌組織結(jié)構(gòu)與功能受損，最終引發(fā)心力衰竭。該病理過程與FARS2參與的線粒體功能穩(wěn)態(tài)維持密切相關(guān)。通過靶向線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)控通路可以部分挽救由于FARS2缺陷導(dǎo)致的線粒體功能障礙及心功能損傷。該研究首次揭示了FARS2對心肌功能維持的關(guān)鍵作用，并為未來FARS2缺陷相關(guān)心肌病治療提供了思路。

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士研究生李博文、高級實(shí)驗(yàn)師劉芳芳為文章的第一作者，空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院吳元明教授、陳琨講師、西京醫(yī)院超聲診斷科劉麗文教授為文章通訊作者。

研究材料
在這項(xiàng)研究中，作者采用Loxp-Cre系統(tǒng)構(gòu)建心肌細(xì)胞特異性Fars2條件性敲除小鼠模型及Fars2條件性點(diǎn)突變小鼠模型（由賽業(yè)生物提供）以及腺相關(guān)病毒構(gòu)建的基因過表達(dá)及敲減小鼠模型。

研究方法
在研究中采用了臨床遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)動物學(xué)、分子生物學(xué)及生物信息學(xué)等研究方法。

技術(shù)路線
01 分析一例HCM患者家系，結(jié)合1141HCM患者測序數(shù)據(jù)，篩選并鑒定得到7個FARS2基因突變，并明確突變體導(dǎo)致蛋白功能缺陷
02 FARS2心肌組織特異性誘導(dǎo)性敲除小鼠及斑馬魚出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大、心力衰竭、壽命縮短等表型
03 03.FARS2缺陷導(dǎo)致小鼠心功能受損、心肌細(xì)胞線粒體功能受損表型
04 通過轉(zhuǎn)錄組測序等方法確定FARS2缺陷導(dǎo)致mt-tRNA^Phe合成、線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)控及蛋白合成收到破壞
05 FARS2缺陷導(dǎo)致線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)被破壞
06 通過干預(yù)線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)可以挽救FARS2缺陷細(xì)胞模型的線粒體功能損傷表型
07 通過干預(yù)線粒體分裂通路可以挽救FARS2缺陷小鼠心肌功能及表型

研究結(jié)果

肥厚型心肌病中鑒定到的FARS2突變體的功能表征[1]

首先，作者在臨床收集了一個HCM家系，通過全外顯子測序及家系共分離分析明確FARS2 p.R415L為該家系的潛在致病突變。由于FARS2與心肌病之前的聯(lián)系尚未報(bào)道，作者進(jìn)一步分析了1141個HCM患者突變數(shù)據(jù)，鑒定到了另外6個疾病相關(guān)FARS2基因突變。為了探索突變體的相關(guān)功能，作者利用分子對接模擬、mRNA、蛋白穩(wěn)定性及線粒體定位分析，明確突變體導(dǎo)致蛋白穩(wěn)態(tài)或線粒體定位能力受損，提示各突變體可能導(dǎo)致FARS2缺陷。此外，作者構(gòu)建了小鼠組成型心肌細(xì)胞特異性FARS2 p.R415L點(diǎn)突變小鼠模型（由賽業(yè)生物提供），并發(fā)現(xiàn)FARS2 p.R415L點(diǎn)突變小鼠在4周齡出現(xiàn)了心室壁增厚等表型。進(jìn)一步證實(shí)了FARS2 p.R415L點(diǎn)突變的潛在致病性。
 

FARS2缺陷會導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心力衰竭及猝死[1]

為了探究FARS2缺陷是否直接導(dǎo)致心肌病，作者構(gòu)建了FARS2心肌細(xì)胞特異性誘導(dǎo)型敲除小鼠（icKO）。研究數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ARS2缺陷導(dǎo)致小鼠生存期大大縮短，且與性別無關(guān)。誘導(dǎo)敲除后，心臟組織出現(xiàn)進(jìn)行性重量增加、肥厚marker基因表達(dá)量增加、心肌纖維化輕微增加、心肌細(xì)胞增粗等表型。為了探究FARS2缺陷導(dǎo)致心肌病的物種保守性，作者構(gòu)建了fars2缺陷斑馬魚模型，結(jié)果表明fars2缺陷導(dǎo)致斑馬魚心前充血增加、心力衰竭、心包水腫。
 

FARS2缺陷導(dǎo)致心肌和線粒體功能缺陷[1]

為了進(jìn)一步明確FARS2缺陷所導(dǎo)致的心臟表型，作者對敲除3周（敲除早期）和敲除10周（敲除晚期）的小鼠進(jìn)行了超聲心動圖檢測。結(jié)果提示FARS2缺陷導(dǎo)致小鼠心功能受損，且隨著時間延長進(jìn)一步加重。透射電鏡結(jié)果顯示icKO小鼠出現(xiàn)線粒體碎片化、纖維水腫和肌絲紊亂，且線粒體內(nèi)出現(xiàn)了“華夫餅”樣形態(tài)學(xué)重塑表型。此外，F(xiàn)ARS2缺陷大鼠原代心肌細(xì)胞表現(xiàn)為有氧氧化能力大幅降低、糖酵解能力輕微增加，提示線粒體功能受損。
 

icKO心臟線粒體穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)合成功能缺陷[1]

作者通過轉(zhuǎn)錄組測序及進(jìn)一步的驗(yàn)證初步探索了FARS2缺陷導(dǎo)致肥厚型心肌病表型的可能分子機(jī)制，認(rèn)為線粒體穩(wěn)態(tài)在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。通過KEGG及GO富集分析發(fā)現(xiàn)線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)通路顯著富集，結(jié)合前期的心臟表型及亞細(xì)胞線粒體形態(tài)改變，作者聚焦于線粒體相關(guān)自噬和線粒體動力學(xué)通路。首先，作者檢測了線粒體OXPHOs含量及mtDNA編碼蛋白含量，發(fā)現(xiàn)icKO晚期FARS2缺陷嚴(yán)重影響了mtDNA編碼基因的表達(dá)，進(jìn)而影響了線粒體呼吸復(fù)合物含量，導(dǎo)致線粒體功能異常，具體體現(xiàn)在ATP含量的下降、活性氧水平的升高。而icKO早期這種變化并不顯著，與所觀察到心臟功能異常表型不一致，通過對mtDNA編碼基因轉(zhuǎn)錄本的檢測，作者認(rèn)為icKO早期mtDNA編碼基因轉(zhuǎn)錄本代償性升高可能增加了線粒體內(nèi)蛋白合成效率，進(jìn)而觀察到OXPHOs蛋白含量沒有顯著改變。
 

FARS2缺陷擾亂了線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)[1]

當(dāng)線粒體功能受損時，細(xì)胞內(nèi)擁有一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)來恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)。那么，線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)通路相關(guān)分子在icKO早期和晚期發(fā)生了什么改變呢？線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)通路主要包括線粒體相關(guān)自噬、線粒體融合與分裂、線粒體生物合成等。首先，作者選擇從全細(xì)胞和線粒體兩個維度進(jìn)行研究。通過檢測線粒體相關(guān)自噬通路關(guān)鍵分子的改變情況，作者觀察到在icKO早期，細(xì)胞內(nèi)自噬流顯著增高，具體表現(xiàn)為LC3Ⅱ/Ⅰ升高、p62降低。作者猜測，細(xì)胞內(nèi)自噬流增強(qiáng)主要是為了通過激活線粒體相關(guān)自噬清除受損線粒體。通過一系列的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者認(rèn)為FARS2缺陷后，線粒體相關(guān)自噬通路持續(xù)被激活，導(dǎo)致PINK1/Parkin/線粒體外膜蛋白泛素化增加，然而細(xì)胞后期缺少成熟的自噬泡，因此沒有足夠的自噬泡用于清除被泛素標(biāo)記的線粒體外膜蛋白，最終導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)異常。

由于線粒體自噬通路需要線粒體經(jīng)過分裂將受損部分線粒體分裂出去，因此，作者進(jìn)一步觀察了FARS2缺陷后心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體動力學(xué)改變情況。從結(jié)果上來看，icKO晚期線粒體分裂蛋白DRP1在線粒體上的顯著募集、線粒體外膜融合蛋白MFN1及內(nèi)膜融合蛋白OPA1的顯著降低均說明線粒體趨向于線粒體碎片化，這些結(jié)果與前期透射電鏡中觀察到的線粒體碎片化相一致。此外，組織線粒體免疫熒光染色也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。而在icKO早期，這些變化并不明顯，這可能是由于分裂后的線粒體通過自噬被及時清除所導(dǎo)致的。
 

3-MA和Mdivi-1減輕了大鼠原代心室肌細(xì)胞中FARS2缺陷誘導(dǎo)的線粒體失穩(wěn)態(tài)[1]

為了進(jìn)一步明確自噬和線粒體分裂在FARS2缺陷所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞線粒體失穩(wěn)中的重要作用并尋找其具體分子機(jī)制，作者利用自噬抑制劑3-MA和線粒體分裂抑制劑Mdivi-1處理大鼠原代心肌細(xì)胞。首先，3-MA和Mdivi-1處理后抑制了由于FARS2缺陷所導(dǎo)致的線粒體自噬通路，3-MA處理后顯著降低了DRP1的S616和S637的磷酸化及FIS1含量，兩種抑制劑處理后恢復(fù)了由于FARS2缺陷所導(dǎo)致的線粒體外膜融合蛋白MFN1及MFN2含量的降低。對線粒體表型進(jìn)行進(jìn)一步檢測，結(jié)果顯示兩種試劑處理后部分挽救了線粒體碎片化結(jié)局。令人興奮的是抑制自噬和線粒體分裂后，部分挽救了由于FARS2缺陷導(dǎo)致線粒體功能損傷的表型，具體表現(xiàn)為線粒體OXPHOs含量部分恢復(fù)，ATP升高、活性氧降低、線粒體膜極性恢復(fù)、線粒體DNA拷貝數(shù)升高、線粒體含量升高等。
 

AAV9介導(dǎo)的Drp1敲減或Mfn1過表達(dá)可減輕Fars2缺陷引起的心肌功能障礙，并延長小鼠的壽命[1]

為了明確線粒體分裂及線粒體相關(guān)自噬在FARS2缺陷導(dǎo)致線粒體功能障礙中的作用及尋找可能的治療策略，作者在體內(nèi)使用了AAV9介導(dǎo)的Drp1-shRNA和Mfn1的過表達(dá)病毒，通過心肌點(diǎn)注射的方式對小鼠進(jìn)行表型挽救。結(jié)果顯示，Drp1的敲減和Mfn1的過表達(dá)均可以部分緩解疾病的進(jìn)展，敲除后10周的心肌肥厚程度輕于對照組（icKO+AAV9-Ctrl），表現(xiàn)為心臟重量較輕、心功能受損程度較輕。并且Mfn1過表達(dá)組的作用要優(yōu)于Drp1敲減組。另外，兩種不同的策略均延長了小鼠的生存期，并且Mfn1過表達(dá)組的生存期要更長一些。綜合這些結(jié)果表明，通過干預(yù)線粒體動力學(xué)可以部分挽救由于FARS2缺陷所導(dǎo)致的小鼠心肌肥厚，并顯著延長了小鼠的生存期。進(jìn)一步證明了FARS2缺陷所導(dǎo)致的線粒體碎片化在心肌病理學(xué)進(jìn)程中的作用，并建立了一種可能的基因治療策略。

研究結(jié)論

本研究首次報(bào)道FARS2是遺傳性心肌病的潛在致病基因。FARS2缺陷通過破壞線粒體穩(wěn)態(tài)和擾亂線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)導(dǎo)致心肌肥厚。該研究不僅揭示了FARS2在心臟中的生物學(xué)功能，而且為線粒體氨酰tRNA合成酶相關(guān)心肌病的分子診斷、預(yù)防和FARS2相關(guān)心肌病的治療提供了新的見解。

原文檢索：
[1]Li B, Liu F, Chen X, et al. FARS2 Deficiency Causes Cardiomyopathy by Disrupting Mitochondrial Homeostasis and the Mitochondrial Quality Control System[J]. Circulation, 2024.
 

Fars2 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Fars2^em1/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-13224
應(yīng)用方向：
代謝,內(nèi)分泌,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見病
 

Fars2 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Fars2^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-14699
應(yīng)用方向：
代謝,內(nèi)分泌,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見病