類(lèi)器官和CRISPR 篩選在疾病建模中的應(yīng)用
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CRISPR/Cas 被認(rèn)為是細(xì)菌或古細(xì)菌在抵抗來(lái)自質(zhì)�；蚴删w的外來(lái) DNA 的過(guò)程中進(jìn)化出的“獲得性免疫系統(tǒng)”。基本原理是通過(guò)一段與靶標(biāo) DNA 相同的 gRNA 指導(dǎo) Cas9 核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行 DNA 修飾，以此造成基因的功能突變或缺失[1]。
結(jié)直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 是男性和女性中第三大最常見(jiàn)的新診斷癌癥類(lèi)型，其特點(diǎn)是患者之間存在顯著的遺傳和表型異質(zhì)性。雖然外顯子組測(cè)序有助于復(fù)發(fā)性遺傳病變的識(shí)別，但檢測(cè)頻率較低。
為了促進(jìn)腫瘤驅(qū)動(dòng)因素的高通量基因測(cè)試和功能鑒定，Michels BE 等人開(kāi)發(fā)了一個(gè)在人類(lèi)結(jié)腸類(lèi)器官中進(jìn)行 CRISPR-Cas9 聯(lián)合篩選的平臺(tái)，使得利用類(lèi)器官進(jìn)行體外和體內(nèi)移植后腫瘤抑制基因的篩選鑒定成為可能[2]。
基于類(lèi)器官的 CRISPR-Cas9 聯(lián)合篩選的平臺(tái)[2]。
首先，作者通過(guò)藥篩系統(tǒng)將攜帶 Cas9 蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)入結(jié)腸類(lèi)器官,建立了穩(wěn)定表達(dá) Cas9 的人結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)體系。正常人結(jié)腸類(lèi)器官對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β) 敏感，在培養(yǎng)體系中添加 TGF-β 可以有效殺死類(lèi)器官，而敲除 TGF-B 的受體基因 (TGFBR) ，即用針對(duì) TGFBR2 的慢病毒 gRNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)則可以挽救 TGF-β 導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。
圖 1. 穩(wěn)定表達(dá) Cas9 的結(jié)腸類(lèi)器官的組織形態(tài)學(xué)[2]。
在對(duì)照培養(yǎng)基中（左）以及在對(duì)照 gRNA（中）或 TGFBR2 gRNA 慢病毒（右）存在下進(jìn)行 TGF-β 選擇 3 周后穩(wěn)定表達(dá) Cas9 的類(lèi)器官的形態(tài)學(xué)。
【參考操作】[2]：
（一）類(lèi)器官的培養(yǎng)：
1.完全培養(yǎng)基:含DMEM/F12，10 mM HEPES, 1x Glutamax, 1x penicillin/streptomycin, 2% B27, 1mM Nicotinamide, 12.5 mM N-Acetylcysteine, 500 nM A83-01, 10 mM SB202190, 50% Wnt3a, 20% R-spondin-1, 10% Noggin、50 ng/mL human EGF。
2. 類(lèi)器官培養(yǎng)基每 2-3 天更換一次，每周傳代一次，并在 Rho 激酶抑制劑 Y-27632 (10 mM) 的存在下培養(yǎng)在基底膜基質(zhì)膠中。
（二）類(lèi)器官的轉(zhuǎn)染：1. 通過(guò)移液多次機(jī)械分散類(lèi)器官，然后進(jìn)行 Accutase 消化以獲得單細(xì)胞。
2. 洗滌后，將細(xì)胞重懸于含有 Rho 激酶抑制劑 (10 μM) 和 Polybrene(8 μg/mL) 的培養(yǎng)基中，并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染 (500*g，1 小時(shí)，32°C)。
3. 37°C 孵育 3-5 小時(shí)后，將細(xì)胞接種到 Matrigel 中。轉(zhuǎn)染后 2 天開(kāi)始選擇。
隨后，作者設(shè)計(jì)了針對(duì) TGF-β 通路的 6 個(gè)關(guān)鍵組分 (圖 2A) 和 94 個(gè)對(duì)照基因。每個(gè)基因都被 20 個(gè)獨(dú)立的 gRNA 靶向，整個(gè)文庫(kù)包含 2,200 個(gè) gRNA，并被轉(zhuǎn)導(dǎo)到穩(wěn)定表達(dá) Cas9 的正常人結(jié)腸類(lèi)器官中 (圖 2 B)。以混合方式提取基因組DNA，并通過(guò) NGS 分析慢病毒條形碼。針對(duì) TGFBR1 和 TGFBR2 的單個(gè) gRNA 富集程度最高，證實(shí)了篩選系統(tǒng)的有效。
圖 2. 使用 TGF-β 耐藥性訓(xùn)練庫(kù)進(jìn)行類(lèi)器官篩選[2]。
接著，作者對(duì)異種移植類(lèi)器官中的腫瘤抑制功能進(jìn)行體內(nèi)篩選。作者構(gòu)建了一種預(yù)致瘤類(lèi)器官系，AK 類(lèi)器官 (APC-KO/KRASGG12D)，即缺失 APC 和致癌 KRASG12D 等位基因的結(jié)腸類(lèi)器官。其僅在敲除 TGFBR2 (AKT 類(lèi)器官) 后才顯示出生長(zhǎng)。
圖3. 腫瘤抑制功能可移植類(lèi)器官模型的開(kāi)發(fā)[2]。
(A) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置。致瘤前類(lèi)器官系（AK：APC-KO 和 KRASG12D）和皮下移植后致瘤系（AKT：額外 TGFBR2 -KO）。(B) NSG 小鼠（n = 7 和 8 只小鼠）中移植 AK 和 AKT 類(lèi)器官后腫瘤體積 (±SEM) 的測(cè)量。(C) AK（上排）和 AKT 類(lèi)器官（下排）移植后的腫瘤形態(tài)。
【參考操作】[2]：
（一）AK（APC−/−，KRASG12D）類(lèi)器官：
1. AK (APC−/−, KRASG12D) 類(lèi)器官按照使用 WT 類(lèi)器官的描述生成。該類(lèi)器官用含有 Cas9 和 APC gRNA 的 lentiCRISPR v2 轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在連續(xù)嘌呤霉素選擇 (0.5 μg/μL)，不含 Wnt、Rspondin 的情況下培養(yǎng)。
2. 分離、擴(kuò)增單個(gè)克隆，并通過(guò) Sanger 測(cè)序證實(shí) APC 突變。
3. KRASG12D 是通過(guò)將 KRAS gRNA 與單鏈修復(fù)模板一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到質(zhì)粒 gRNA_GFP-T2 中而引入的。在不含 Wnt、Rspondin 和 EGF 且添加 0.5-1.0 mM EGFR 抑制劑的培養(yǎng)基中選擇類(lèi)器官。
4. 擴(kuò)增克隆系，并通過(guò) Sanger 測(cè)序證實(shí) KRASG12D 突變。（二）AKT 類(lèi)器官：
通過(guò)慢病毒 gRNA 將 TGFBR2-KO 引入 AK 類(lèi)器官中，然后在缺乏 TGF-β 抑制劑 (A83-01) 且補(bǔ)充有 5 ng/mL 重組人 TGF-β 的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，然后通過(guò) Sanger 測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。
作者設(shè)計(jì)了一個(gè)泛癌 TSG gRNA 庫(kù)，其中包含先前研究中發(fā)現(xiàn)的 85 個(gè) TSG。對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)，設(shè)計(jì)了 20 個(gè)獨(dú)立的 gRNA，包括對(duì)照在內(nèi)，整個(gè)文庫(kù)包含 2,600 個(gè) gRNA。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，AK 類(lèi)器官注射移植到 8-10 只 NSG 小鼠皮下（圖 4)。11 至 12 周后，匯集所有腫瘤的基因組 DNA，并在 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)中進(jìn)行篩選，通過(guò)檢測(cè) sgRNA 序列的富集情況來(lái)判斷發(fā)生突變的功能因子。篩選結(jié)果顯示, TGFBR2是所有三個(gè)重復(fù)中富集度最高的 gRNA，表明 TGF-β 在腫瘤微環(huán)境中具有主導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用。提示該篩選體系可以有效的進(jìn)行腫瘤抑制因子的體內(nèi)篩選。
圖 4. 移植人體類(lèi)器官中腫瘤抑制功能的體內(nèi)文庫(kù)篩選[2]。
此外，也有一些針對(duì)非功能基因的 gRNA 被富集，表明存在假陽(yáng)性。作者通過(guò)在sgRNA 載體引入 UMI (unique molecular identifiers) 的方式，顯著提高了篩選的準(zhǔn)確性，降低了假陽(yáng)性率。該方法體系還可以擴(kuò)展到結(jié)腸以外其它上皮細(xì)胞的篩選,將來(lái)可能用于個(gè)性化的腫瘤治療。
看了這么多，相信大家對(duì)類(lèi)器官的培養(yǎng)方法有了大概的了解。 MCE 現(xiàn)已推出類(lèi)器官相關(guān)產(chǎn)品 55 折活動(dòng)，截止到 2024.04.30，心動(dòng)不如行動(dòng)，來(lái) MCE 官網(wǎng)查詢(xún)具體的產(chǎn)品信息吧！
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MCE 的所有產(chǎn)品僅用作科學(xué)研究或藥證申報(bào)，我們不為任何個(gè)人用途提供產(chǎn)品和服務(wù)。
[1] Zhu Y. Advances in CRISPR/Cas9. Biomed Res Int. 2022 Sep 23;2022:9978571.
[2] Michels BE, et al. Pooled In Vitro and In Vivo CRISPR-Cas9 Screening Identifies Tumor Suppressors in Human Colon Organoids. Cell Stem Cell. 2020 May 7;26(5):782-792.e7.
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