研究背景

臨床前試驗(yàn)是開發(fā)新藥的基礎(chǔ)，在這一過程中，研究人員通常采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，以研究靶分子在體內(nèi)的生物分布。隨著光學(xué)技術(shù)和熒光探針設(shè)計(jì)的進(jìn)步，這種方式正在臨床前成像中成為主要方法。

作者首次使用三維光學(xué)成像設(shè)備，通過特異性熒光探針檢測(cè)血栓形成過程中活化的血小板。血小板能夠促進(jìn)凝血以維持血管完整性。通過血小板表面的特異性單鏈抗體(scFv)片段(GPIIb/IIIa)，可以將靶向活化血小板的分子探針用于體內(nèi)成像，作者先前已經(jīng)將這種單鏈抗體應(yīng)用于各種分子成像模式，如超聲成像、PET和MRI。

在本次研究中，作者開發(fā)了靶向scFv活化血小板近紅外熒光探針，基于FLECT成像技術(shù)評(píng)價(jià)其診斷血栓形成和溶栓藥物藥效作用。

部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果

頸動(dòng)脈血栓形成FLECT/CT成像

將小鼠左頸動(dòng)脈血管暴露接觸氯化鐵，誘導(dǎo)血栓形成。隨后注射Targ-Cy7或Mut-Cy7熒光探針，45分鐘后在FLECT成像設(shè)備上掃描，可視化小鼠體內(nèi)的近紅外熒光三維分布。隨后立即進(jìn)行X射線計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)，以確定小鼠的解剖結(jié)構(gòu)，從而捕獲熒光信號(hào)的體內(nèi)精確定位。

結(jié)果表明，注射Targ-Cy7熒光探針后能夠清晰檢測(cè)到血栓(圖1B)。該信號(hào)定位于小鼠的左側(cè)頸動(dòng)脈血管。

對(duì)血栓所在的感興趣區(qū)域的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，與Mut-cy7熒光探針在小鼠體內(nèi)的弱信號(hào)相比，Targ-Cy7熒光探針能夠顯著提高檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度(圖1C)。證明了FLECT成像設(shè)備檢測(cè)體內(nèi)血栓的能力。

作者隨后對(duì)頸動(dòng)脈血管進(jìn)行組織病理分析，以確認(rèn)所有小鼠(Targ-Cy7和 Mut-Cy7)左側(cè)血管存在血栓，而右側(cè)血管健康無血栓(圖1D)。每條左頸動(dòng)脈中檢測(cè)到的Targ-Cy7 FLECT信號(hào)與其血栓重量呈顯著正相關(guān)(圖1E，p =0.0006，r = 0.9807)。

圖1頸動(dòng)脈血栓形成FLECT/CT成像

閉塞性血栓形成FLECT/CT成像

除了上述的非閉塞性血栓形成模型，作者利用FLECT/CT檢測(cè)Targ-Cy7在完全閉塞的血栓模型成像(圖2)。

然而，在全閉塞模型中，檢測(cè)到的體內(nèi)FLECT和離體信號(hào)均低于在非閉塞血栓中觀察到的信號(hào)。并且熒光信號(hào)與相應(yīng)的血栓重量之間沒有顯著相關(guān)性。

這些數(shù)據(jù)表明，Targ-Cy7與完全閉塞血栓的結(jié)合較少，可能是由于血液循環(huán)受到限制，使熒光探針不能被均勻攜帶至所有血栓區(qū)域。

圖2閉塞性血栓形成FLECT/CT成像

溶栓治療效果FLECT/CT成像

為了證明 FLECT/CT 成像設(shè)備具備治療效果監(jiān)測(cè)能力，頸動(dòng)脈血栓小鼠模型注射Targ-Cy7，并在整合素聯(lián)合抗血小板溶栓在治療前、后進(jìn)行掃描(圖3A)。

正如預(yù)期的那樣，FLECT/CT在治療前檢測(cè)到小鼠左頸動(dòng)脈血栓中Targ-Cy7熒光探針的積聚。在初始掃描之后，小鼠接受治療以破壞形成的血栓，并利用FLECT/CT 再次成像。

治療后的掃描結(jié)果顯示，在血栓區(qū)先前檢測(cè)到的Cy7-NIR信號(hào)消失，提示這種溶栓治療策略的有效性。

作者隨后使用兩個(gè)治療組的受損血管的離體成像和組織學(xué)分析證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3B)。

圖3溶栓治療效果FLECT/CT成像

肺栓塞FLECT/CT成像

在FLECT/CT 成功診斷氯化鐵動(dòng)脈血栓形成模型后，作者進(jìn)一步確定 FLECT/CT能否發(fā)現(xiàn)靜脈血栓引起的肺栓塞。靜脈血栓是常見的死亡原因，臨床上難以診斷，這顯然需要更好的非侵入性成像技術(shù)。

小鼠靜脈注射栓塞劑誘導(dǎo)血小板活化和形成，停留在肺微血管中的血栓，導(dǎo)致肺栓塞。注射凝血素后觀察小鼠呼吸困難，注射熒光探針45分鐘后。然后在FLECT/CT成像設(shè)備上掃描小鼠。

使用Targ-Cy7熒光探針小鼠診斷為肺栓塞（圖4），由于肺在正常CT掃描上沒有形成對(duì)比，因此在安樂死后將造影劑灌注到器官中，并對(duì)小鼠進(jìn)行重新掃描，以確保檢測(cè)到的FLECT信號(hào)確實(shí)定位于肺（圖3A，底部）。

對(duì)感興趣區(qū)域的定量分析顯示，Targ-Cy7小鼠的熒光信號(hào)水平明顯高于其對(duì)照組-熒光探針，（p=0.0286）（圖4B）。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)和對(duì)肺的組織學(xué)分析證實(shí)，這些信號(hào)與肺中的血栓有關(guān)（圖4C）

三維熒光發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（InSyTe FLECT/CT）應(yīng)用聚焦

Karlheinz Pete研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了靶向活化血小板特異性的免疫近紅外探針，并利用InSyTe FLECT/CT無創(chuàng)監(jiān)測(cè)動(dòng)物體內(nèi)血栓栓塞的診斷和治療作用。

Karlheinz Pete認(rèn)為，無論是在研究血栓形成機(jī)制方面，還是在新型溶栓藥物的開發(fā)篩選方面。能夠非放射性、無創(chuàng)檢測(cè)血栓栓塞的三維熒光掃描成像技術(shù)，具有低成本和高靈敏度的特點(diǎn)，在臨床前心血管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中上發(fā)揮重要作用。
 

期刊名稱：Theranostics
原文標(biāo)題：A Unique Recombinant Fluoroprobe Targeting Activated Platelets Allows In Vivo Detection of Arterial Thrombosis and Pulmonary Embolism Using a Novel
Three-Dimensional Fluorescence Emission Computed Tomography (FLECT) Technology
作者：Bock Lim *，Karlheinz Peter ,et,al.
發(fā)表單位：Atherothrombosis & Vascular Biology, Baker IDI Heart and Diabetes Institute, Melbourne, Australia
發(fā)表時(shí)間：2017年2月
DOI：https://doi.org/10.7150/thno.18099