卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是影響女性生殖系統(tǒng)的三種常見惡性腫瘤之一。轉(zhuǎn)錄因子Forkhead box蛋白O1（FoxO1），又稱forkhead橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）轉(zhuǎn)錄因子，屬于Forkhead box O（FoxO）轉(zhuǎn)錄因子家族，處于腫瘤分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心。大量研究表明，F(xiàn)oxO1失衡與腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的病理過程密切相關(guān)。然而，關(guān)于FoxO1在OC中的作用沒有統(tǒng)一的結(jié)論。

2024年2月25日，醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京大學(xué)）竇環(huán)博士團(tuán)隊(duì)以“FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4”為題在《Cancer Science》雜志發(fā)表研究論文，討論了FoxO1在OC中的作用和分子機(jī)制，表明了FoxO1驅(qū)動(dòng)的4號(hào)染色體結(jié)構(gòu)維持（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）表達(dá)對(duì)OC發(fā)生至關(guān)重要，本研究可能為OC患者的早期診斷和靶向治療提供重要啟示。


標(biāo)題：FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4（FoxO1增加SMC4轉(zhuǎn)錄和METTL14介導(dǎo)m6A修飾以促進(jìn)卵巢癌發(fā)展）
時(shí)間：2024-2-25
期刊：Cancer Science
影響因子：IF 5.7
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq等
 
研究摘要
轉(zhuǎn)錄因子FoxO1與卵巢癌（OC）發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其作用和分子機(jī)制尚不清楚。本研究分析結(jié)果解釋了FoxO1在OC患者的臨床樣本中高表達(dá)，且與預(yù)后不良顯著相關(guān)。FoxO1敲低在體外和體內(nèi)抑制OC細(xì)胞增殖。ChIP-seq結(jié)合GEPIA2和Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，4號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)維持（SMC4）是FoxO1的下游靶標(biāo)，F(xiàn)oxO1通過與其-1400/-1390 bp啟動(dòng)子結(jié)合來促進(jìn)SMC4轉(zhuǎn)錄。SMC4高表達(dá)顯著阻斷了FoxO1敲低的腫瘤抑制作用。此外，F(xiàn)oxO1通過轉(zhuǎn)錄激活甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）并增加其編碼序列區(qū)域上的SMC4 m6A甲基化來增加SMC4 mRNA豐度。癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集分析證實(shí)了OC中FoxO1、SMC4和METTL14表達(dá)之間存在顯著正相關(guān)�？傊�，這項(xiàng)研究揭示了FoxO1調(diào)控SMC4的分子機(jī)制，并在OC發(fā)生過程中FoxO1/METTL14/SMC4的表達(dá)之間建立了臨床聯(lián)系，從而提供了潛在的診斷靶點(diǎn)和治療策略。
  （1）卵巢癌（OC）中FoxO1過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。
圖1：FoxO1在OC組織中上調(diào)，F(xiàn)oxO1的高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。
（A）FoxO1基因在GSE18520的OC和正常卵巢組織中的表達(dá)水平。
（B）IHC檢測(cè)到34例OC組織和鄰近正常對(duì)照組織中FoxO1表達(dá)的代表性圖像。
（C-D）  FoxO1染色強(qiáng)度（C）和定量分析（D）的代表性圖像。
（E）使用Kaplan–Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析了TCGA和GEO數(shù)據(jù)集中OC患者的OS和PFS。

表1：OC患者FOXO1蛋白水平與臨床病理特征的關(guān)系。

（2）FoxO1在體外促進(jìn)OC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 （A-B）  用FoxO1過表達(dá)質(zhì)�；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染的OC細(xì)胞系中FoxO1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的比較。
（C）    使用CCK-8法分析細(xì)胞活力。
（D）    通過菌落形成實(shí)驗(yàn)確定的菌落的代表性圖像。
（E–H）  通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EdU（E）、細(xì)胞周期（F）和凋亡（H）檢測(cè)到的細(xì)胞增殖；（G）western blot檢測(cè)G1/S期標(biāo)記蛋白。
（I）     劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。比例尺=400μm。
（J-K）   通過transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移（J）和侵襲（K）能力。比例尺=200μm。
  圖3：FoxO1沉默在體外抑制OC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)其凋亡。
（A-B）  用siFoxO1或siNC轉(zhuǎn)染的OC細(xì)胞系中FoxO1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的比較。
（C）    使用CCK-8測(cè)定法分析細(xì)胞活力。
（D）    通過菌落形成實(shí)驗(yàn)確定的菌落的代表性圖像。
（E–H）  通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定EdU（E）、細(xì)胞周期（F）和凋亡（H）檢測(cè)到的細(xì)胞增殖；（G）western blot檢測(cè)G1/S期標(biāo)記蛋白。
（I）     劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。比例尺=400μm。
（J-K）   通過transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移（J）和侵襲（K）能力。比例尺=200μm。
 
（3）敲低FoxO1抑制體內(nèi)OC腫瘤發(fā)生 圖4：FoxO1的敲低抑制了C57BL/6小鼠中ID8衍生的原位異種移植物的生長(zhǎng)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shNC或靶向FoxO1的shRNA的ID8細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背側(cè)（n=6）。
（A-B）  通過RT-qPCR和western blot驗(yàn)證慢病毒產(chǎn)生穩(wěn)定FoxO1敲低細(xì)胞系。
（C-E）  （C）腫瘤結(jié)節(jié)、（D）腫瘤重量和（E）小鼠異種移植物腫瘤體積的生長(zhǎng)曲線。
（F）    小動(dòng)物的活體成像檢測(cè)異種移植腫瘤的熒光強(qiáng)度。
（G）    IHC檢測(cè)shNC和shFoxO1腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)。

4、SMC4受FoxO1轉(zhuǎn)錄調(diào)控
圖5：FoxO1直接激活OC中的SMC4轉(zhuǎn)錄。
（A）   OC中FoxO1下游靶標(biāo)的篩選策略圖。
（B）   使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)分析了OC和正常卵巢組織樣品之間DEG的火山圖。
（C）   DEG的GO富集分析（列出了前20位）。
（D）    ChIP-seq分析ID8細(xì)胞中FoxO1結(jié)合序列在DNA長(zhǎng)度上的分布。
（E）    FoxO1結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域中基因的維恩圖以及細(xì)胞遷移、增殖和周期的DEG。
（F）    RT-qPCR檢測(cè)FoxO1的36個(gè)潛在結(jié)合靶標(biāo)的表達(dá)，并穩(wěn)定敲低FoxO1及其對(duì)照細(xì)胞。
（G-H）  在FoxO1的高表達(dá)或敲低后檢測(cè)到SMC4的mRNA和蛋白質(zhì)水平。
（I）     FoxO1與SMC4啟動(dòng)子序列結(jié)合的IGV圖。
（J）     JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了SMC4啟動(dòng)子區(qū)域中潛在的FoxO1結(jié)合位點(diǎn)和motif。
（K）     ChIP-qPCR驗(yàn)證SMC4啟動(dòng)子處FoxO1的富集水平。
（L）     SMC4啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因示意圖。
（M）    轉(zhuǎn)染FoxO1過表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒后，檢測(cè)到SMC4-WT、SMC4-MUT或SMC4-TRU結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性。
（N）    轉(zhuǎn)染FoxO1過表達(dá)或穩(wěn)定敲低FoxO1及其對(duì)照ID8細(xì)胞的對(duì)照質(zhì)粒后，檢測(cè)到具有WT結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性。

（5）SMC4介導(dǎo)FoxO1加重體內(nèi)OC惡性表型 (A-B)   在GEO數(shù)據(jù)集中比較OC組織與正常上皮組織中SMC4的表達(dá)水平。
(C-D)   使用Kaplan–Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA和GSE9891數(shù)據(jù)集中OC患者的總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）。
(E-F)   檢測(cè)轉(zhuǎn)染SMC4高表達(dá)質(zhì)粒或siSMC4后的SMC4 mRNA和蛋白水平。
(G)    使用CCK-8實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞活力。
(H)    通過集落形成實(shí)驗(yàn)確定的代表性圖像。
(I–L)   通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)EdU標(biāo)記的細(xì)胞增殖（I）、細(xì)胞周期（J）和凋亡（L）；
(K)    通過western blot檢測(cè)G1/S期標(biāo)記蛋白。
(M)    使用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。比例尺= 400μm。
(N)    通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。比例尺= 200μm。
(O)    通過western blot檢測(cè)TGF-β/Smad和JAK2/STAT3通路分子的蛋白表達(dá)變化。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了shNC或針對(duì)FoxO1的shRNA的ID8細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背部側(cè)翼（n = 6），并在腫瘤內(nèi)注射高表達(dá)SMC4的慢病毒或?qū)φ詹《尽?br /> (P)    在腫瘤中檢測(cè)SMC4的蛋白表達(dá)水平。
(Q-S)  小鼠異種移植物的腫瘤結(jié)節(jié)(Q)、腫瘤重量(R)以及腫瘤體積(S)生長(zhǎng)曲線。

(6) FoxO1通過METTL14介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)SMC4 mRNA的穩(wěn)定性
圖 7：FoxO1通過調(diào)調(diào)控METTL14介導(dǎo)的m6A修飾來促進(jìn)SMC4表達(dá)。
(A)    在用放線菌素D（5微克/毫升）處理0、3或6小時(shí)后，使用RT-qPCR分析FoxO1低表達(dá)對(duì)ID8細(xì)胞中SMC4 mRNA半衰期的影響。
(B)    在FoxO1高表達(dá)后，檢測(cè)m6A修飾關(guān)鍵調(diào)控基因的mRNA水平。
(C)    在FoxO1高表達(dá)后，檢測(cè)m6A修飾關(guān)鍵調(diào)控基因的蛋白水平。
(D)    使用Kaplan–Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析GSE30161數(shù)據(jù)集中OC患者的總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）。
(E-F)   在轉(zhuǎn)染高表達(dá)METTL14質(zhì)�；騭iMETTL14后，檢測(cè)METTL14和SMC4的mRNA和蛋白水平變化。
(G)    使用Western blot檢測(cè)在敲低FoxO1后高表達(dá)METTL14對(duì)METTL14和SMC4蛋白水平的影響。
(H)    使用METTL14-RIP-qPCR檢測(cè)FoxO1敲低后SMC4 mRNA的富集情況。
(I)     SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)中SMC4 mRNA的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示m6A修飾的潛在位點(diǎn)。紅色箭頭指向高置信度位點(diǎn)。
(J)     使用MeRIP-qPCR檢測(cè)在METTL14低表達(dá)后SMC4 mRNA預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的富集情況。
(K)    使用RT-qPCR分析METTL14高或低表達(dá)對(duì)SMC4 mRNA半衰期的影響。
(L)     在ID8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有RNA甲基化編輯器和gRNA或非靶向gRNA（NT-gRNA）的慢病毒后，通過RT-qPCR檢測(cè)SMC4 mRNA的半衰期。
(M)    在ID8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含有RNA甲基化編輯器和gRNA或NT-gRNA的慢病毒后，檢測(cè)SMC4 mRNA和蛋白的表達(dá)。
(N)    在ID8中敲低FoxO1后，使用MeRIP-qPCR檢測(cè)SMC4 mRNA預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的富集情況。
(O)    使用ChIP-qPCR鑒定FoxO1在METTL14啟動(dòng)子的富集水平。
(P)    在轉(zhuǎn)染FoxO1過表達(dá)或?qū)φ召|(zhì)粒后，檢測(cè)METTL14-WT、METTL14-MUT結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶活性。
 
（7）OC中FoxO1、SMC4和METTL14的表達(dá)呈正相關(guān) 圖8：在臨床樣本和小鼠模型中，F(xiàn)oxO1、SMC4和METTL14在卵巢癌（OC）中的相關(guān)性分析。
(A)    散點(diǎn)圖顯示了來自TCGA的376名OC患者OC組織中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA的相關(guān)性。
(B)    使用斯皮爾曼相關(guān)性分析檢測(cè)了12只小鼠異種移植物中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA水平之間的相關(guān)性。
(C)    工作模型展示了通過轉(zhuǎn)錄激活和增加METTL14介導(dǎo)的m6A修飾來調(diào)控SMC4，從而促進(jìn)OC的發(fā)展。

研究小結(jié)：
本研究揭示了FoxO1在卵巢癌（OC）中的致癌作用，以及FoxO1在SMC4的轉(zhuǎn)錄激活和METTL4介導(dǎo)的m6A修飾機(jī)制。FoxO1可以直接與SMC4啟動(dòng)子結(jié)合，以促進(jìn)SMC4的翻譯，此外，F(xiàn)oxO1還可以直接與METTL14啟動(dòng)子結(jié)合，并通過m6A METTL14依賴性方式促進(jìn)SMC4的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)OC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖8C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)oxO1/METTL14/SMC4軸是診斷和治療OC的一個(gè)有前景的因素。
 
參考文獻(xiàn)：
Tan L, Wang S, Huang S, Tie Y, Sai N, Mao Y, Zhao S, Hou Y, Dou H. FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6 A modification of SMC4. Cancer Sci. 2024 Feb 25. doi: 10.1111/cas.16120. PubMed PMID: 38403332.