前言
細(xì)胞與基因治療（CGT）在現(xiàn)代醫(yī)療尤其是癌癥和遺傳病的治療領(lǐng)域有著極大的發(fā)展空間，目前國內(nèi)外已有多款包括溶瘤病毒藥物在內(nèi)的CGT藥物獲批上市。

溶瘤病毒（OV）是一類新興的癌癥治療藥物，是目前研究較多的新型基因治療藥物。其中Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）重組病毒載體被廣泛用作OV載體^[1]，具有感染譜廣、病毒基因組容量大、對(duì)人體致病性較弱、可提高抗腫瘤療效等優(yōu)點(diǎn)。

本文基于迪必爾生物CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)生物反應(yīng)器建立單純皰疹病毒載體HSV-1的制備工藝，驗(yàn)證了高通量微小型生物反應(yīng)器在單純皰疹病毒基因治療應(yīng)用領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)和適配性。

方法與結(jié)果
本工藝實(shí)驗(yàn)在迪必爾生物“應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE）-病原微生物實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）”開展，所用病毒載體為中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院提供的Ⅰ型單純皰疹病毒重組病毒載體HSV-1-GFP。使用迪必爾生物 CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)生物反應(yīng)器（圖1）進(jìn)行Vero細(xì)胞的培養(yǎng)。在初始200 mL工作體積下，Vero細(xì)胞接種密度為5×10⁵ cells/mL，微載體濃度為5 g/L。本次實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置如表1所示。溫度由半導(dǎo)體Peltier模塊的加熱和制冷實(shí)現(xiàn)無水控溫。DO由空氣和氧氣的通氣速率級(jí)聯(lián)控制。pH由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級(jí)聯(lián)控制。其中，進(jìn)氣模式均為底部通氣。

表1 反應(yīng)器工藝參數(shù)



圖1 CloudReady™生物反應(yīng)器

為維持罐內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)水平并減少代謝物累積，Day2~3以1VVD的灌流速度進(jìn)行灌流，Day0~3微載體上細(xì)胞密度變化如圖2所示。為保證病毒載體充分接觸并感染Vero細(xì)胞，在Day3細(xì)胞剛好鋪滿微載體而尚未達(dá)到最高細(xì)胞密度時(shí)，換液75%并以MOI=0.1接入HSV-1-GFP病毒載體。在Day5接毒48h后補(bǔ)充100 mL新鮮培養(yǎng)基，此后維持工作體積300 mL。Day6~7每天收獲50%上清液并補(bǔ)入等量新鮮培養(yǎng)基，Day8收獲全部上清液。
 

圖2 Day 0 ~ Day 3微載體上細(xì)胞密度變化曲線

在整個(gè)培養(yǎng)周期中，葡萄糖濃度維持在1g/L以上，葡萄糖和乳酸濃度變化如圖3所示。由每天取樣鏡檢圖像（圖4）可見，Day3時(shí)細(xì)胞剛好鋪滿微載體，此時(shí)接毒感染細(xì)胞，Day5開始觀察到CPE，部分細(xì)胞形態(tài)變圓，Day6~8呈現(xiàn)明顯CPE，最終大部分細(xì)胞裂解凋亡并脫落，上清液中可見細(xì)胞碎片。
 

圖3 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線

圖4 每24 h取樣鏡檢圖

每天留取7 mL懸液混合后進(jìn)行TCID₅₀測(cè)試，通過Reed-Muench法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析^[2]，計(jì)算TCID₅₀值為7.17×10⁶/mL。取200 μL懸液提取基因組，配置熒光定量體系（SYBR Green / ROX），通過qPCR方法檢測(cè)CT值為15.06。

結(jié)論

在病毒載體制備的工藝開發(fā)中，由于不同種類的病毒在感染宿主細(xì)胞時(shí)通常會(huì)表現(xiàn)出對(duì)特定細(xì)胞株的選擇性，并且關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）如溫度、DO、pH、細(xì)胞密度、MOI、TOI、HOI等都需要進(jìn)行測(cè)試和優(yōu)化^[3]。迪必爾生物 CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器（圖5）應(yīng)用靈活，可實(shí)現(xiàn)各類貼壁或懸浮細(xì)胞高密度培養(yǎng)，進(jìn)行批次、補(bǔ)料、灌流等多種生物工藝的開發(fā)和優(yōu)化，助力將QbD理念貫徹到病毒載體制備的工藝開發(fā)進(jìn)程，在基因治療領(lǐng)域發(fā)揮應(yīng)用潛力。
 

圖5 CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器

參考文獻(xiàn)

[1] Manservigi R, Argnani R, Marconi P. HSV recombinant vectors for gene therapy[J]. The Open Virology Journal, 2010, 18(4): 123-156

[2] Lei C, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus Infectivity. Virol Sin. 2021, 36(1):141-144.

[3] Sascha Kiesslich, Amine A. Kamen. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances, 2020(44), 107608.

應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心(CARE) 張君軒 供稿