相信很多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的同學(xué)對(duì)細(xì)胞消化做了許多研究，實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐們也得出了很多有價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)也遇到很多人的困惑。在這里結(jié)合各位實(shí)驗(yàn)專家和自己的經(jīng)驗(yàn)，介紹一些細(xì)胞消化基本操作知識(shí)和注意事項(xiàng)，如果不足之處，歡迎補(bǔ)充討論。

 

我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)時(shí)大部會(huì)以貼壁的形式生長（除了取自血、脾或骨髓的細(xì)胞），使用的完全培養(yǎng)基中的血清，含有許多帶陽性電荷的促細(xì)胞附著因子（層黏連蛋白 Laminine、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質(zhì)），能幫助細(xì)胞附著于帶陰性電荷的底物上，并形成鍵結(jié)、貼壁伸展。也就是所謂的～細(xì)胞消化Cell Detachment

 

 

01

常見細(xì)胞消化法

常見細(xì)胞消化法有三種　

機(jī)械消化法、離子螯合法、酶消化法　

 

一 、機(jī)械消化法

直接用液體吹打或用刮刀，施予外力讓細(xì)胞與培養(yǎng)底物分離；適用于貼壁性弱的細(xì)胞傳代，但相較于其它消化方法，這種外力無法量化控制，細(xì)胞分散效果差，且可能會(huì)造成大量細(xì)胞破損，使內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基，進(jìn)而影響細(xì)胞傳代狀態(tài)。
 

▲細(xì)胞刮勺

 

二 、離子螯合法

細(xì)胞膜表面蛋白大多需要鈣、鎂離子來維持與胞外基質(zhì)的穩(wěn)定鍵結(jié)，當(dāng)然也包含各種黏附蛋白（例：整合素、鈣黏著蛋白、橋粒等），螯合劑會(huì)在不破壞細(xì)胞膜表面蛋白的狀況下，抽離這些離子，使黏附蛋白失活而減少細(xì)胞-細(xì)胞間及細(xì)胞-底物間的連接作用，讓細(xì)胞較容易在施予外力時(shí)，脫離培養(yǎng)底物并促進(jìn)細(xì)胞分散。

0.02% EDTA是細(xì)胞傳代最常用的離子螯合劑，在37℃作用效果最佳（消化較敏感的細(xì)胞可在4℃作用），適用于消化一般貼壁性細(xì)胞或細(xì)胞表面標(biāo)記實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

 

但EDTA無法用血清終止其反應(yīng)，所以在消化細(xì)胞后必須用緩沖鹽溶液（如：PBS）清洗離心，以免影響后續(xù)細(xì)胞貼盤效果。

▲ EDTA（黑）能螯合二價(jià)離子（紅）

 

三 、酶消化法

用蛋白水解酶消化連接細(xì)胞及培養(yǎng)底物的蛋白質(zhì)，適用于消化貼壁性稍強(qiáng)的細(xì)胞。

 

上述實(shí)驗(yàn)方法中最常見的還是胰酶消化。大部分細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可，但是我們發(fā)現(xiàn)吸去胰蛋白酶后，殘留的那些附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2分鐘足夠消化細(xì)胞（絕大部分1分鐘不到）。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對(duì)細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是先采用PBS潤洗細(xì)胞吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化細(xì)胞。

 

02

什么程度算消化完全呢？

所謂消化并不是細(xì)胞全部分散分布形成單個(gè)圓形才算消化完好，一般我們?nèi)庋塾^察貼壁細(xì)胞表層，只要能漂浮移動(dòng)了，多半呈沙粒狀漂浮移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了。說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是完全成單個(gè)細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會(huì)聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性。

 

細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個(gè)時(shí)候即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時(shí)間。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個(gè)視細(xì)胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因?yàn)橘N壁過程中重新聚集了。

 

如果遇到比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動(dòng)，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。

 

針對(duì)消化時(shí)間和細(xì)胞類型、消化液的消化能力、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時(shí)間，掌握細(xì)胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強(qiáng)，配好后可分裝成小管，一次用完，其余凍在-20℃，以保持酶活力。細(xì)胞生長到覆蓋70～80％瓶底時(shí)消化較好，若細(xì)胞密度過大則消化后細(xì)胞易成團(tuán)。

 

我們常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外），受消化影響不是很大。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝，對(duì)細(xì)胞代數(shù)，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求極高。這個(gè)時(shí)候，胰酶消化，就是潤洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

 

03

細(xì)胞消化的時(shí)候需用胰酶潤洗一遍

吸去胰酶后，殘留的那些無法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對(duì)細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化。比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育。

 

04

消化的影響

常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化（難消化細(xì)胞例外）即可。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝，對(duì)細(xì)胞代數(shù)，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求極高。這個(gè)時(shí)候，胰酶消化，就是潤洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

 

05

EDTA的作用

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理。一般不要試圖延長消化時(shí)間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。

 

06

PBS洗滌注意事項(xiàng)

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因?yàn)镾erum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問可以講，對(duì)于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制trypsin的活性。但對(duì)于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液。

 

來源:細(xì)胞之邦

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