使用細(xì)胞器選擇性染色劑或染料讓細(xì)胞器顯色是細(xì)胞和組織熒光成像的關(guān)鍵。這些特異性染色劑適合用作抗體復(fù)染劑，幫助識別細(xì)胞內(nèi)特定位置的目標(biāo)靶點。除了固定細(xì)胞的研究外，對活細(xì)胞的研究可以更好的了解細(xì)胞內(nèi)生命活動的狀態(tài)及其變化，其難點在于活細(xì)胞細(xì)胞膜的選擇透過性，會阻止外界物質(zhì)的進出，因此選擇合適的熒光染料至關(guān)重要。
 

本文主要針對以下幾個常見的亞細(xì)胞架構(gòu)：細(xì)胞骨架、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞核、溶酶體、細(xì)胞膜，為大家介紹如何在活細(xì)胞或固定細(xì)胞中選擇合適的試劑/探針分別對它們進行染色。

 

一、細(xì)胞骨架

1.1 肌動蛋白

1.1（a）活細(xì)胞肌動蛋白染色：

對于活細(xì)胞中的肌動蛋白染色，可以通過帶有熒光染料的肌動蛋白，或帶有GFP標(biāo)記的肌動蛋白來進行染色。雖然熒光肌動蛋白能夠最準(zhǔn)確的定位出靶點肌動蛋白的結(jié)構(gòu)，但對于某些細(xì)胞（如原代細(xì)胞），通過顯微注射或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑的手段，較難實現(xiàn)將熒光肌動蛋白引入目標(biāo)細(xì)胞中。此時最好的方式是使用低細(xì)胞毒性、高特異性、可通過活細(xì)胞的細(xì)胞呈象探針（SIR-actin™）
 

《Natural Method》中，就描述了如何利用這種探針來進行細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的活細(xì)胞呈象，如圖2所示。同時，其中還就染色探針在長期成像濃度下對細(xì)胞的毒性進行了研究，結(jié)果表明在24小時內(nèi)，SiR -tubulin和SiR -actin對原代人成纖維細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。
 

圖1. 結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡(Structured illumination microscopy，SIM)下，使用SIR -tubulin(左)或SIR -actin(右)染色的人成纖維細(xì)胞。

 

圖2. 對SiR-tubulin（上）和SiR-actin（下）熒光染色探針毒性測試結(jié)果。白色亮點代表代表沒辦法繼續(xù)進行有絲分裂或由于細(xì)胞骨架的改變無法在表面繼續(xù)生長的細(xì)胞。

 

1.1（b）固定細(xì)胞肌動蛋白染色：

最常見的固定細(xì)胞中肌動蛋白染色劑是鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)物（phalloidins）。帶正電或負(fù)電的熒光染料會通過非特異性的離子相互作用與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致產(chǎn)生更高的背景；Actin-stain系列的鬼筆環(huán)肽熒光探針是非離子型的，因此更有助于獲得理想的低背景結(jié)果。
 

圖3. 在Swiss3TS細(xì)胞中，使用 anti-vinculin（紅色）進行，Dapi進行核染(藍(lán)色)，用Actin -stain™488 Phalloidin (# PHDG1, Cytoskeleton對F-actin進行染色(綠色)

 

 

若實驗中使用到甲醛進行固定或透化，甲醛會破壞鬼筆環(huán)肽的天然結(jié)構(gòu)，因此可以考慮使用免疫熒光法對固定細(xì)胞中的肌動蛋白進行染色。如今被發(fā)現(xiàn)的肌動蛋白亞型總共有6種，包括α-actin （ACTA1）、平滑肌α-actin（ACTA2）、細(xì)胞質(zhì)β-actin（ACTB）、心肌α-actin（ACTC1）、細(xì)胞質(zhì)γ-actin（ACTG1）、平滑肌γ-actin（ACTG2/ACTA3）。針對不同亞型的肌動蛋白，可以選擇不同的特異性一抗。
 

1.2 微管蛋白

微管蛋白（Tubulin）的染色和肌動蛋白類似，固定細(xì)胞中可以使用鬼筆環(huán)肽和免疫熒光法；活細(xì)胞中則可以使用特殊的熒光探針進行顯色。

 

二、細(xì)胞核

對細(xì)胞核進行染色主要是利用能與DNA相結(jié)合的染料或探針，活細(xì)胞的細(xì)胞核熒光探針，如SiR™、SPY™、Hoechst™等；固定細(xì)胞的細(xì)胞核染料：DAPI和溴化乙錠（EB）。

 

2.1 活細(xì)胞中細(xì)胞核的染色
 

圖4. 使用SPY™505-DNA（綠色）和SPY555-actin（洋紅色）對Hela活細(xì)胞進行復(fù)染。

 

2.2 固定細(xì)胞中細(xì)胞核的染色

固定細(xì)胞還可以使用免疫熒光法對細(xì)胞和進行染色定位，此時可以精確的定位到核膜和核仁，如圖5(綠色熒光)所示：

 

圖5. 免疫熒光法分別對核膜(A) / 細(xì)胞核(B) /核仁 (C) / 細(xì)胞核(剔除核仁) (D)進行染色（綠色熒光）。

 

圖5中使用的相關(guān)抗體：

貨號	產(chǎn)品	染色部位	抗體靶標(biāo)基因
AMAb91251	Monoclonal Anti-LMNB1 Antibody	Nuclear membrane	Lamin b1
AMAb90959	Monoclonal Anti-PARP1 Antibody	Nucleus	poly (ADP-ribose) polymerase 1
AMAb90961	Monoclonal Anti-NIFK Antibody	Nucleoli	Nucleolar protein interacting with the fha domain of mki67
AMAb90549	Monoclonal Anti-FUS Antibody	Nuclear (without nucleoli)	fused in sarcoma

 

三、線粒體

線粒體是細(xì)胞中重要的功能器官，使用特定的熒光染料或探針對其進行染色，可作為細(xì)胞是否健康的重要指標(biāo)之一。染料在線粒體上的積累和定位取決于線粒體膜電位，在有線粒體膜電位的健康細(xì)胞中，會顯示明亮的熒光信號，而在失去線粒體膜電位的細(xì)胞中，則熒光信號弱。

 

3.1 活細(xì)胞中線粒體染色

為了在活細(xì)胞中對線粒體標(biāo)記，也需要借助專門的熒光探針試劑。細(xì)胞將在一定濃度的特定探針中培養(yǎng)，接著探針通過被動擴散穿過細(xì)胞膜并在活性線粒體中積累。一旦線粒體被探針標(biāo)記，細(xì)胞就可以用醛基固定劑進行處理，以便對樣本進一步處理。因為MitoTracker® Red CMXRos和MitoTracker® Deep Red FM探針產(chǎn)生的熒光波長更長，因此適用于多重染色標(biāo)記實驗中。

 

部分相關(guān)染料推薦：

貨號	產(chǎn)品	Abs (nm)	Em (nm)	活/固定細(xì)胞
9074	MitoTracker®Green FM	490	516	活細(xì)胞
2252	LumiTracker® Mito Orange CMTMRos	551	576	活細(xì)胞
9082	MitoTracker® Red CMXRos	579	599	活細(xì)胞
3170	LumiTracker® Mito Red FM	581	644	活細(xì)胞
8778	MitoTracker® Deep Red FM	644	665	活細(xì)胞

 

3.2 固定細(xì)胞中線粒體染色

在固定細(xì)胞中，有許多可用的線粒體標(biāo)志物，常見的線粒體標(biāo)志物如表1所示

蛋白名稱	基因名稱	Uniprot ID
Apoptosis-inducing factor 1 , mitochondrial	AIFM1	O95831
Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial	COX4I1	P13073
Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial	CPS1	P31327
FAST kinase domain-containing protein 2, mitochondrial	FASTKD2	Q9NYY8
Hexokinase-1	HK1	P19367
Heat shock 70 kDa protein 1A	HSPA1A	PODMV8
60 kDa heat shock protein, mitochondrial	HSPD1	P10809
Mitochondrial dynamics protein MID51	MIEF1	Q9NQG6
Cytochrome c oxidase subunit 1	MT-CO1	P00395
NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 7, mitochondrial	NDUFS7	O75251
Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM16	PAM16	Q9Y3D7
Prohibitin	PHB	P35232
Superoxide dismutase [Cu-Zn]	sOD1	P00441
Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog	TOMM22	Q9NS69
Elongation factor Tu, mitochondrial	TUFM	P49411
Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1	UCP1	P25874
Mitochondrial uncoupling protein 2	UCP2	P55851
Mitochondrial uncoupling protein 3	UCP3	P55916
Voltage-dependent anion-selective channel protein	VDAC1	P21796

表1. 常見的線粒體標(biāo)志物。

 

四、溶酶體

溶酶體是動物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，內(nèi)部含有豐富的水解酶，其結(jié)構(gòu)的完整性與生命體的生理病理均有著密切的關(guān)系。
 

4.1 活細(xì)胞溶酶體染色

常見的針對活細(xì)胞中溶酶體的熒光探針包括LysoTracker™系列，由于其對酸性細(xì)胞器有高度選擇性（溶酶體內(nèi)部pH約3.5~5），因此可以對溶酶體進行特異性染色。
 

相比LysoTracker™，LysoBrite™的探針在長時間追蹤活細(xì)胞中的溶酶體上，具有更明顯的優(yōu)勢。LysoBrite™染料可以在活細(xì)胞中停留超過一周，細(xì)胞毒性極小，而LysoTracker染料只能使用幾個小時。且LysoBrite™染料比LysoTracker染料更具有光穩(wěn)定性，如圖6所示。

 

圖6.A: LysoBrite™ Red染色, B: LysoTracker™ Red (來自Invitrogen)進行染色的Hela細(xì)胞圖像。用Olympus熒光顯微鏡對0秒和120秒曝光時間下的信號進行比較

 

Name	Excitation (nm)	Emission (nm)
LysoBrite™ Blue	434	480
LysoBrite™ Green	501	510
LysoBrite™ Red	576	596
LysoBrite™ Deep Red	597	619
LysoBrite™ NIR	636	651

表2. LysoBrite™系列探針的激發(fā)/吸收波長對比表

 

五、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體主要負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分類，因此，針對這兩個細(xì)胞器的大部分染色探針都是脂質(zhì)或是可以影響蛋白質(zhì)運動的化學(xué)物質(zhì)。在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中，ER和高爾基體的扁平膜囊可以用各種親脂探針進行染色，然后根據(jù)其形態(tài)進行區(qū)分。

5.1 活細(xì)胞中ER和高爾基體的染色

ER-Tracker™ 系列的染色探針針對的是活細(xì)胞，對ER具有高度選擇性。這些染料很少染色線粒體，不像傳統(tǒng)的ER染色劑DiOC6(3) (D273)，ER-Tracker™ 探針的對細(xì)胞毒性很小。當(dāng)使用特定優(yōu)化方案對細(xì)胞進行染色時，即使經(jīng)過甲醛的處理，染色模式仍然保留。

還有一類熒光鞘脂衍生物（sphingosine derivative），如NBD C6-ceramide、BDP FL-ceramide等，也是ER/高爾基體在活細(xì)胞中的重要染色探針之一。

 

六、細(xì)胞膜

細(xì)胞脂膜是動態(tài)的、流體結(jié)構(gòu)(約4納米厚)，這是生物學(xué)上的必要條件，因為若要細(xì)胞參與基本的細(xì)胞和亞細(xì)胞生理功能（如遷移、細(xì)胞擴散、吞噬、細(xì)胞分裂、內(nèi)吞、機械轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等），則需要這些細(xì)胞膜/基質(zhì)膜能夠改變形狀和張力。
 

6.1 活細(xì)胞中細(xì)胞膜染色

對細(xì)胞膜張力的研究在細(xì)胞生理學(xué)中很重要。熒光膜張力探針Flipper-TR®(Spirochrome, Ltd.)可以對活細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)進行特異性染色，以對膜的張力進行研究。如圖6所示，對經(jīng)歷了高滲透沖擊的細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進行可視化分析。
 

圖7. 使用Flipper-TR®探針對細(xì)胞進行染色。在高滲透沖擊前(上)和沖擊后(下)染色的Flipper-TR®圖像�；叶缺硎緹晒鈴姸�，彩色編碼表示熒光壽命。右邊的直方圖顯示了滲透沖擊后的壽命變化。

 

除此之外Flipper-TR®探針還提供針對其他細(xì)胞器膜/基質(zhì)膜（Plasma membrane）的染色，如溶酶體膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。