多功能酶標儀在微生物生長測定原理前景解析的應用

瀏覽次數(shù)：2512　發(fā)布日期：2024-2-6　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

600nm波長處的光密度（OD₆₀₀）可反映細菌和酵母等微生物的生長信息。更具體地說，反映種群中微生物數(shù)量隨時間的變化情況。

微生物生生長曲線

監(jiān)測微生物種群隨時間的變化，可繪制出一條生長曲線（圖1），分為四個生長階段：

遲緩期

Lag phase

少量微生物被置入培養(yǎng)基（接種）開始培養(yǎng)后，需要一段時間適應新環(huán)境。在此期間不會發(fā)生分裂，種群密度保持不變。

對數(shù)期

Log phase

當微生物適應了新的環(huán)境，就會開始增殖。細胞數(shù)量在一段時間內(nèi)以幾何級數(shù)增加。對數(shù)期是微生物分裂最活躍的時期，可用于進一步計算倍增時間和生長速率等參數(shù)。

穩(wěn)定期

Stationary phase

微生物的増殖受到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的限制。一旦碳源或其他必需成分消耗殆盡，就會停止分裂。微生物生長曲線在這一階段的特點表現(xiàn)為微生物種群密度穩(wěn)定保持在較高水平。

衰亡期

Death phase

隨著營養(yǎng)物質(zhì)、鹽、氨基酸的耗盡，以及酸或乙醇等有害廢物的積累，微生物培養(yǎng)環(huán)境條件惡化，微生物種群開始衰亡。這表現(xiàn)為微生物密度整體呈下降趨勢。

圖1：微生物生長曲線。分批培養(yǎng)中微生物數(shù)量的典型變化過程。

利用OD₆₀₀測量微生物生長的原理

OD₆₀₀基于吸收光檢測，測量的是穿過樣品，即微生物懸液的光。透射光與微生物的生長有什么關系？由于溶液中的微粒會產(chǎn)生散射光，微粒（微生物）越多，散射的光就越多。因此，隨著細菌或酵母數(shù)量成倍增長，光散射程度和測量的吸光度值會變大。同時，這意味著只是通過吸收光模式測定光散射的程度，而不是衡量分子對光的選擇性吸收。這一點至關重要：OD₆₀₀實際上測量的是散射引起的透射光損失，而不是吸光度！

多種生物和醫(yī)學研究領域都要用到有關微生物生長的信息：

抗生素耐藥性

感染多重耐藥病原體的人數(shù)和因感染而死亡的人數(shù)不斷增加。亟需開發(fā)新型藥物或方法，來控制這些病原體。在新抗菌藥物的研發(fā)過程中，要用到OD₆₀₀評估其對微生物生長的抑制作用，以確定藥物的有效性。

微生物生產(chǎn)

微生物本身可以成為工業(yè)產(chǎn)品，可用于生產(chǎn)烘焙食品或奶酪等，還可用于生產(chǎn)酶、抗生素、維生素等產(chǎn)品。對于這兩種用途，都需要在過程初始對生長特性等方面進行菌種優(yōu)化。生產(chǎn)過程一經(jīng)建立，就需要進行微生物監(jiān)測。同樣，要用到OD₆₀₀監(jiān)測過程中的微生物生長情況。

合成生物學

使用基因工程經(jīng)典方法來構建具有預定特性的生物系統(tǒng)。這意味著要對生物 “機器”進行合理設計，包括對基因進行高度改造，甚至是改造成完全人工基因組。其目的是生產(chǎn)出石化產(chǎn)品替代品，如生物燃料或塑料，以及能感知污染物或降解塑料的微生物產(chǎn)品。常用的微生物有大腸桿菌（E. coli）和釀酒酵母菌（S. Cerevisiae）等，需要通過OD₆₀₀監(jiān)測其生長情況。

用OD₆₀₀檢測微生物生長的注意事項

如前所述，OD₆₀₀測量的是散射光，而非吸收光。理論上，描述吸光度與吸收分子濃度線性關系的朗伯-比爾定律不適用于OD₆₀₀測量。但實踐證明，盡管不使用吸光度，比爾-朗伯定律仍適用于低密度培養(yǎng)物。換句話說，OD₆₀₀值可以直接與極低密度懸液中的微生物數(shù)量相關。對于密度較高的培養(yǎng)物，OD₆₀₀的測量結果呈拋物線狀。只有將OD₆₀₀值與一系列微生物數(shù)量進行校準后，才能計算出這種培養(yǎng)物中的微生物數(shù)量。

選擇比色皿還是微孔板？

如果要對大容量的樣品進行過程監(jiān)測，推薦使用比色皿。每隔一定時間（如1小時）取樣一次，測定微生物的種群密度。每次檢測需要約1.5ml微生物懸液，并且需要留出一定時間進行樣品抽�。▓D2）。

圖2：從酵母發(fā)酵罐中取樣。

微孔板則用于微生物生長的持續(xù)監(jiān)測。只需200µl懸液，以設定的時間間隔自動檢測生長過程。通常使用的是96孔板，非常適合多種樣品的重復測量，以及比較不同的培養(yǎng)基條件或菌株。對于中高通量應用，可實現(xiàn)流程自動化。

如何選擇檢測儀器？

以吸收光模式測定顆粒的光散射時，使用不同的儀器得出的結果可能會有所差異。原因在于光束的類型不同，探測器與樣品的距離也不同�？梢韵胂�，當通過微生物的光束發(fā)生散射，距離較近的探測器更容易捕捉到光線，而距離較遠的探測器則有可能捕捉不到（圖3）。因此，建議使用可用OD₆₀₀來檢測微生物生長過程的一系列專用儀器。

圖3：不同的檢測儀器會產(chǎn)生不同的結果。該圖展示探測器位置的影響：在尺寸相同的情況下，距離樣品較近的探測器可檢測到散射光，而距離樣品較遠的探測器則檢測不到光信號。

顯然，比色皿或微孔板的使用限制了選擇范圍，二者分別對應分光光度計和酶標儀。但像SPECTROstar® Nano這種兼具比色皿和微孔板檢測能力的儀器，可以滿足您當下和未來的所有需求（圖4）。

圖4：BMG LABTECH的SPECTROstar® Nano是一款帶有比色皿端口的酶標儀。

什么情況下需要校準？

如果需要用OD₆₀₀值來確定溶液中的微生物數(shù)量/濃度（如每毫升的微生物數(shù)量），或者需要對OD₆₀₀散射測量的非線性性質(zhì)進行校正，需要進行校準。為了進行測量，需要制備已知微生物濃度的微生物懸浮液，并使用與后續(xù)實驗相同的樣品量在所選儀器上測量OD₆₀₀。用測量值生成校準曲線，隨后可將未知樣品的OD₆₀₀值與該曲線相關聯(lián)，并反算出濃度。由于光散射會隨著顆粒大小和形狀的變化而變化，因此對每種微生物都要進行校準。同樣，在更換分析儀器或樣品量時也需要進行校準。

OD600測量的前景

利用微孔板測量OD₆₀₀的方法越來越多地與發(fā)光或熒光等檢測模式相結合。微生物生長測量值可用于其他檢測法的歸一化處理。例如在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）期刊發(fā)表的一篇文章中，一項研究使用 CLARIOstar® 多功能酶標儀測量金/黃/色/葡/萄/球/菌（Staphylococcus aureus）的翻譯。使用熒光模式測量了β-半乳糖苷酶報告基因，并將表示酶活性的信號歸一化為OD₆₀₀。另一個例子是使用化學發(fā)光法檢測單核細胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）基因表達，并將其歸一化為OD₆₀₀值。

檢測微生物生長的其他方法

散射比濁法

利用散射比濁法檢測微生物生長也是基于光散射原理。與測量散射導致的透射損失的OD₆₀₀值不同，散射比濁法直接檢測散射光。這是BMG LABTECH的NEPHELOstar® Plus（圖5）的強項。與基于吸光度模式的方法相比，散射比濁法的靈敏度更高，可檢測顆粒數(shù)量較低的樣品，因此適用于檢測微生物數(shù)量極少的懸液。