基于質(zhì)譜 (MS) 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)助力生物學(xué)研究
基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)已成為生物學(xué)研究的有力工具，而質(zhì)譜本質(zhì)上是不能用于蛋白質(zhì)定量分析的，因為不同的蛋白質(zhì)和多肽具有不同的離子化效率，而穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸（如 2H(D)，13C，15N 和 18O）引入蛋白質(zhì)中可以很好的解決這個問題。
細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù) (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC) 是基于質(zhì)譜 (MS) 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)中一種簡單、穩(wěn)定而強(qiáng)大的方法。它于 2022 年被丹麥 Mann 實驗室的 Ong 等人首次用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)，可提供準(zhǔn)確的相對定量，無需任何化學(xué)衍生或者其它操作，廣泛用于研究細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、藥物學(xué)等研究領(lǐng)域[1][2][3][4]。
下面就跟著 M 君先來探索下 SILAC 的技術(shù)原理及實驗流程吧~
▐ SILAC 基本原理及流程
基于代謝將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸整合到整個蛋白質(zhì)組中，兩組細(xì)胞同時培養(yǎng)，一組是包含正常（輕）氨基酸（Light）的培養(yǎng)基培養(yǎng)（圖 1a，左），另一組組則為同位素標(biāo)記或者含有“重型（Heavy）”的氨基酸培養(yǎng)基（圖 1a，右）。
細(xì)胞傳代培養(yǎng) 5-6 代后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到蛋白中，取代了原有的氨基酸，兩個蛋白之間就存在分子量的改變，而無其它化學(xué)性質(zhì)的差異。然后將兩組細(xì)胞混合，提取出蛋白質(zhì)后酶解，并用質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測分析[1]。
圖 1. SILAC 實驗概述[1]。
SILAC 實驗包括兩個不同的階段 —— 適應(yīng) (a) 和實驗 (b) 階段。
(a) 在適應(yīng)階段，細(xì)胞在輕的和重的 SILAC 培養(yǎng)基中生長，直到重的細(xì)胞完全融入重的氨基酸 (紅星)。這使得兩個 SILAC 細(xì)胞池可以通過 MS 完全區(qū)分 (黑點和紅星，分別表示輕和重 SILAC 肽)，然后可以混合并作為一個樣品處理。適應(yīng)階段可以包括細(xì)胞擴(kuò)增以達(dá)到實驗所需的皿數(shù)。
(b) 在第二階段，兩個細(xì)胞群被不同的處理，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)組的變化�；旌蠘悠罚瑏喌鞍踪|(zhì)組可通過富集步驟或其他分離純化，消化成肽作為一個單一池，并通過 MS 進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量分析[1]。
▐ SILAC 技術(shù)中同位素標(biāo)記氨基酸的選擇
理想情況下，SILAC 氨基酸應(yīng)該是培養(yǎng)細(xì)胞存活所必需的氨基酸，從而確保特定氨基酸的唯一來源是培養(yǎng)基。亮氨酸[1][5]、賴氨酸和蛋氨酸是必需氨基酸，已被用于 SILAC[6][7]。
在早期的 SILAC 研究中，選擇氘 (2H) 標(biāo)記的亮氨酸作為標(biāo)記氨基酸[1][5]。然而，氘標(biāo)記的肽在反相色譜期間的層析位移影響了定量的準(zhǔn)確性。后來使用了 13C 或15N 標(biāo)記的氨基酸，因為這些 SILAC 肽對在 LC-MS/MS 分析中會發(fā)生共洗脫[3]。雖然精氨酸 (R) 不是一種必需氨基酸，但它已被證明對許多培養(yǎng)的細(xì)胞系是必需的，并已成功用于 SILAC 標(biāo)記。由于在后續(xù)的蛋白質(zhì)譜分析之前，要先用胰蛋白酶 (Trypsin) 將蛋白“切割”成肽段，Trypsin 特異性地從蛋白質(zhì)的賴氨酸 (K) 和精氨酸 (R) 殘基處“切割”，最終超 95% 的肽段都是以 K 和 R 結(jié)尾，這也使其質(zhì)譜定量信息更豐富，定量結(jié)果更精準(zhǔn)。因此越來越多的研究者采用 13C 和15N 標(biāo)記的精氨酸和賴氨酸的組合作為標(biāo)記氨基酸[3]。
酪氨酸是另一種在 SILAC 中使用的非必需氨基酸。采用重標(biāo)記酪氨酸鑒定酪氨酸激酶的底物，研究蛋白酪氨酸磷酸化的動態(tài)變化[8][9]。
常用的培養(yǎng)基中的輕重氨基酸列表如下：
表 1. 常用的培養(yǎng)基中的輕重氨基酸。
基于 SILAC 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以用于鑒定外源性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (Protein–protein interactions, PPIs)(圖 2A)、內(nèi)源性 PPls (圖 2B)、或誘導(dǎo)型 PPls 中的特異性相互作用蛋白 (圖 2C)[3]。
圖 2. SILAC 定量相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)[3]。
研究外源蛋白復(fù)合物時 (圖 2A)，野生型細(xì)胞或表達(dá)親和標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞在輕或重的培養(yǎng)基中生長。然后從輕和重細(xì)胞裂解物的混合物純化免疫親和蛋白復(fù)合物[3]。
研究內(nèi)源性蛋白復(fù)合物時 (圖 2B)，在輕或重培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中通過 RNAi 敲低所靶蛋白。然后用來自輕和重細(xì)胞裂解物混合物的相應(yīng)抗體對蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行免疫沉淀[3]。在誘導(dǎo)型 PPls 的情況下 (圖 2C)，通過在輕或重培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中的特異性刺激來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后從輕和重細(xì)胞裂解物的混合物中免疫親和純化。獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物后，將蛋白質(zhì)消化成肽并用 LC-MS/MS 進(jìn)行分析。特異性相互作用蛋白或非特異性背景蛋白可以通過它們的 SILAC 比率來區(qū)分[3]。
至此，同位素標(biāo)記氨基酸與 SILAC 的親密關(guān)系解密完成，此外，小 M 還整理了 SILAC 的技術(shù)優(yōu)勢 ，一起看看吧~
表 2. SILAC 技術(shù)優(yōu)勢。
| L-Lysine-13C6 dihydrochloride 人類必需的氨基酸。 |
| L-Arginine-13C6 hydrochloride 合成一氧化氮的氮供體，是血管擴(kuò)張劑。 |
| L-Leucine-d10 一種必需的支鏈氨基酸。 |
| L-Proline-13C5 人體中二十種氨基酸之一，用于構(gòu)建蛋白質(zhì)。 |
| L-Methionine-13C5 一種必需氨基酸。 |
| L-Valine-d8 一種必需氨基酸。 |
| γ-Aminobutyric acid-d6 是成年哺乳動物大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。 |
| L-Tryptophan-d5 一種必需氨基酸。 |
| 特級胎牛血清，烏拉圭 MCE 胎牛血清 (Fetal Bovine Serum) 來源于非疫區(qū)健康牛 (不含 BVDV、PI3、IBR、BTV 等牛源病毒)，由剖腹產(chǎn) 6-8 月齡胎牛的血液制備而成，產(chǎn)地烏拉圭。 |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100×) MEM 非必需氨基酸溶液 (100×)，是已經(jīng)過濾除菌，可直接使用的常用細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，其主要促進(jìn)細(xì)胞生長和存活，減少體外細(xì)胞的生物合成負(fù)擔(dān)。 |
| 青霉/鏈霉素雙抗溶液 Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile 是已過濾除菌，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)的雙抗溶液。 |
| 抗生素-抗真菌素溶液 MCE Antibiotic-Antifungal (100 ×), Sterile 含青霉素（10 KU/mL）、鏈霉素（10 mg/mL）、兩性霉素 B（25 μg/mL）。青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。 |
| 無血清/無蛋白細(xì)胞凍存液 MCE 無血清無蛋白細(xì)胞凍存液是一種非程序性即用型細(xì)胞凍存液。該產(chǎn)品既適用于常規(guī)哺乳動物細(xì)胞的凍存，也適用于無血清培養(yǎng)細(xì)胞的凍存。 |
參考文獻(xiàn):
[1] Ong SE, et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 2002 May; 1(5):376-86.
[2] Krijgsveld J, et al. Metabolic labeling of C. elegans and D. melanogaster for quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 2003 Aug; 21(8):927-31.
[3] Chen X, et al. Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments. Proteomics. 2015 Sep; 15(18):3175-92.
[4] Ong SE, et al. A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Nat Protoc. 2006; 1(6):2650-60.
[5] Foster, et al. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100,5813–5818.
[6] Everley, et al. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research. Mol. Cell Proteomics 2004, 3,729–735.
[7] Ong, et al. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nat.Methods 2004, 1, 119–126.
[8] Ibarrola, et al. A novel proteomic approach for specific identification of tyrosine kinase substrates using [13C] tyrosine. J. Biol. Chem. 2004,279, 15805–15813.
[9] Tzouros, et al., Development of a 5-plex SILAC method tuned for the quantitation of tyrosine phosphorylation dynamics. Mol. Cell Proteomics 2013, 12, 3339–3349.
標(biāo)簽：
同位素 蛋白質(zhì)組學(xué) 質(zhì)譜
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