米曲霉（Aspergillus oryzae）屬于好氧性絲狀真菌，其菌落生長快，質地疏松，最初為白色，后變?yōu)辄S綠、綠色或深綠色（圖1）。分生孢子起初呈現(xiàn)橢圓形或洋梨形，待成熟后大多轉變?yōu)榍蛐位蛘呓�球形。分生孢子頭呈放射狀存在，少數(shù)為疏松柱形（圖2）^[1]。

圖1 米曲霉平板涂布圖

 

米曲霉已被美國食品藥品監(jiān)督管理局FDA認證為普遍安全菌株（GRAS）。在我國，米曲霉主要用作釀造食品醬、醬油和各類酒，也可用于生產各類益生素、有機酸、各類動物飼料、酶制劑等。在眾多工業(yè)化生產菌株中，米曲霉占有重要地位^[2]。

 

圖2 米曲霉在顯微鏡下的菌體狀態(tài)

 

米曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)時間長，且反應條件不易控制，重復性較差，而液體發(fā)酵培養(yǎng)時間相對較少，反應條件容易實時監(jiān)控，易于工業(yè)擴大化生產^[3]。

 

本文采用迪必爾生物的CloudReady™云平臺平行生物反應器，驗證了不同碳源對米曲霉培養(yǎng)的工藝優(yōu)化。結果顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)對數(shù)期時，玉米糊精對米曲霉的菌體生長更有利。但是在放罐時（112h），以葡萄糖和玉米粉為復合碳源的罐體呈現(xiàn)了最優(yōu)的結果，菌體濕重達到602.3g/L，為所有實驗組的最高水平。本研究可為絲狀真菌的液體發(fā)酵提供數(shù)據支持。

 

研究方法

 

實驗菌種：

米曲霉（As 3.863）購自廣東省微生物菌種保藏中心。種子液孢子數(shù)：2.35×10⁷個/mL，接種量5%。

 

實驗設備：

迪必爾生物CloudReady™1.5L×4云平臺平行生物反應器。

 

工藝參數(shù)條件：見表2

 

 

結果和分析

 

本次培養(yǎng)周期為112h，其中在66h時，四個罐體自動同步開始流加（2ml/h，50%葡萄糖）補料，且在89h后，自動同步增加補料速度（15ml/h，50%葡萄糖）。

 

圖3 各罐不同時間發(fā)酵液狀態(tài)

 

圖4 各罐不同發(fā)酵時間菌體濕重

 

以玉米糊精為碳源的R1和R2，在40-64h期間，菌體濕重分別增加231.4g/L和211.1g/L，達到最大值。但是在流加補糖后，其增長速度逐漸緩慢，甚至R2呈下降趨勢，這有可能是由于此時間段，碳源不同，導致米曲霉的代謝途徑不同，以至于消耗葡萄糖的速度不一致，產生糖阻遏現(xiàn)象。
 

 

從整體的結果可知，以葡萄糖和玉米粉為復合碳源的R4，在放罐時，菌體濕重最高，達到602.3g/L。這表明，在該補料速度的情況下，該復合碳源更適合米曲霉菌體的增殖。但是以玉米糊精為碳源的R1和R2的潛力不可忽視，除去補料速度對其產生的影響因素，玉米糊精對米曲霉的菌體增殖效果更加明顯，如果根據其自身的耗糖速度進行補料速度的策略調整后，最終結果也是不可小覷的。

 

總結

本次實驗基于CloudReady™1.5L×4云平臺平行生物反應器具有良好的平行性這一優(yōu)勢，進行了不同碳源或復合碳源的篩選（圖6），米曲霉的菌體濕重從40.2g/L增長至602.3g/L，同時，我們也得到驗證，米曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)對數(shù)期時，玉米糊精更有利于菌體生長。

 

圖6  T&J CloudReady™1.5L×4平行生物反應器

 

迪必爾生物 應用技術與工程研究中心CARE 管志欣供稿

 

參考文獻

[1]孟廣超.基于ARTP技術篩選高產氨肽酶米曲霉菌株及發(fā)酵和酶解條件優(yōu)化的研究[D].鄭州大學,2021.DOI:10.27466/d.cnki.gzzdu.2021.002649

[2]劉琪聰.米曲霉蛋白酶與異源蛋白表達水平關系的研究[D].江西科技師范大學,2022.DOI:10.27751/d.cnki.gjxkj.2022.000136

[3]王浩,盧梓熒,譚穎斯等.響應面法優(yōu)化米曲霉液體發(fā)酵生產中性蛋白酶工藝[J].中國釀造,2017,36(12):40-45.