RNA m6A修飾在促進(jìn)玉米籽粒發(fā)育過程中的DNA甲基化互作研究中的應(yīng)用
mRNA中的N6-甲基腺苷（m6A）和DNA中的5-甲基胞嘧啶（5mC）對(duì)于調(diào)控基因表達(dá)和調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育具有關(guān)鍵功能。然而，m6A和5mC之間的互作是一個(gè)難以捉摸的領(lǐng)域，在植物中的機(jī)制尚不清楚。
2023年11月23日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賀巖教授課題組以“RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development“為題在《Plant Physiol》雜志發(fā)表研究論文，研究揭示了玉米（Zea mays）籽粒發(fā)育過程中m6A和5mC之間的密切關(guān)系，至少部分歸因于ZmMTA（Zea mays MTA，m6A關(guān)鍵參與因子）和ZmDDM1（5mC關(guān)鍵參與分子）之間的相互作用，且RNA修飾和DNA甲基化之間的互作可能在植物中保守。
標(biāo)題：RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development（RNA m6A修飾促進(jìn)玉米籽粒發(fā)育過程中的DNA甲基化）
時(shí)間：2023-11-28
期刊：Plant Physiology
影響因子：IF 7.4/ 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq（m6A-seq）、BS-seq、RNA-seq等
研究摘要：
本研究通過m6A-seq和BS-seq等分析揭示了玉米（Zea mays）中m6A和5mC之間通過mRNA腺苷甲基化酶（ZmMTA）（m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的關(guān)鍵因子）與DNA甲基化1（ZmDDM1）（調(diào)控DNA甲基化的關(guān)鍵染色質(zhì)重塑因子）減少之間的相互作用而發(fā)生串?dāng)_。與無m6A修飾的基因相比，帶有m6A修飾的基因具有更高水平的DNA甲基化。ZmMTA功能喪失導(dǎo)致玉米胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育過程中嚴(yán)重停滯，導(dǎo)致m6A修飾基因5'區(qū)CHH甲基化顯著降低。而ZmDDM1功能喪失對(duì)ZmMTA相關(guān)活性沒有明顯影響。這項(xiàng)研究在玉米籽粒發(fā)育過程中建立了m6A和5mC之間的直接聯(lián)系，并提供了RNA修飾和DNA甲基化之間相互作用的見解。
研究結(jié)果
（1）RNA m6A修飾與DNA甲基化之間的相互作用
圖1：m6A修飾和DNA甲基化的協(xié)作。
A. 在genebody及其±2 kb區(qū)域中，比較每個(gè)序列背景（CG，CHG和CHH）的所有基因（帶有或不帶有m6A修飾）的DNA甲基化水平。m6A修飾基因是指具有m6A peaks的基因，m6A沉默基因是指沒有m6A peaks的基因。總基因n=20316，帶有m6A修飾基因n=7472，不帶有m6A修飾基因n=12844。使用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
B. 不同m6A強(qiáng)度的基因的DNA甲基化譜。所有m6A修飾基因根據(jù)m6A強(qiáng)度從高到低分為3組，分別用紅色、藍(lán)色和黑色表示。將具有高水平和中等水平m6A修飾基因分別與具有中等水平和低水平m6A修飾的基因進(jìn)行比較。每組基因n=2490。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
（2）ZmMTA在玉米胚乳發(fā)生和胚乳發(fā)育中的作用
圖2：ZmMTA功能喪失嚴(yán)重阻礙了玉米的胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育。
A. ZmMTA基因結(jié)構(gòu)圖和EMS突變位點(diǎn)。黑色框和白色框分別表示外顯子和UTR。紅色框表示MT-A70域的編碼區(qū)。EMS突變位點(diǎn)用三角形標(biāo)記。
B. zmmta-1/+在14 DAP（左）和成熟期（右）的自交穗。代表性的突變核用紅色箭頭表示。對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)字提取以進(jìn)行比較。Bar=1 cm。
C. 4~14 DAP野生型和zmmta-1突變體核的石蠟切片。這些切片用堿性品紅染色。Bars=1 mm。
D. 突變位點(diǎn)的野生型和zmmta-1突變體進(jìn)行Sanger測序。
E. Western blot檢測野生型和ZmMTA-1突變體核中ZmMTA蛋白的表達(dá)。
F. 野生型和zmmta-1突變體在14 DAP時(shí)的流式細(xì)胞術(shù)圖譜。C值顯示在每個(gè)peak頂部。
G. LC-MS/MS分析顯示野生型和zmmta-1突變體的總mRNA m6A豐度。數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)。
（3）zmmta功能喪失影響大量基因的表達(dá)和胚胎發(fā)育
圖3：野生型和zmmta-1突變體中轉(zhuǎn)錄組比較分析。
A~B. 相對(duì)于野生型，zmmta-1突變體中的DEGs（A）或TEs（B）。DEGs（或TEs）（倍數(shù)變化≥2，F(xiàn)DR<0.01）用紅色或藍(lán)色表示，而未變化的基因（或TEs）用灰色表示。
C. zmmta-1胚胎中下調(diào)（上）或上調(diào)（下）DEG的GO富集分析。圓圈的大小表示DEG的數(shù)量。顏色表示每個(gè)GO項(xiàng)的-log 10（P值）。
（4）ZmMTA對(duì)于m6A修飾基因的5'區(qū)域的mCHH是必需的
圖4：ZmMTA促進(jìn)m6A修飾基因5'區(qū)的mCHH。
A） 野生型和zmmta-1突變體中的整體DNA甲基化水平。使用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)野生型和zmmta-1突變體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)：*P<0.05和**P<0.01。
B） 野生型和zmmta-1突變體中帶有或不帶有m6A修飾的基因中DNA甲基化（CG，CHG和CHH）的宏基因譜。野生型和zmmta-1突變體中m6A+的n=7472，m6A-的n=12844。使用野生型和zmmta-1突變體之間的雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。
（5）ZmMTA與ZmDDM1的相互作用
B） Y2H（酵母雙雜交）實(shí)驗(yàn)顯示ZmMTA與ZmDDM1A或ZmDDM1 B的相互作用。AD表示GAL4激活域；BD表示GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。使用空的pGADT7和pGBKT7載體之間的相互作用作為陰性對(duì)照。
C） LCI（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）實(shí)驗(yàn)顯示N.benthamiana葉片中ZmMTA與ZmDDM1A或ZmDDM1B的相互作用。左上部分顯示互作信號(hào)；其他3個(gè)部分顯示陰性對(duì)照信號(hào)。每個(gè)部分旁邊的標(biāo)簽表示特定的組合。熒光信號(hào)強(qiáng)度表示相互作用活性。
（6）RNA m6A修飾促進(jìn)ZmDDM1靶向TSS
B. 野生型ZmDDM1占比Metaplots圖�；趍6A修飾和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）占比情況將所有表達(dá)的基因分為4類。在有或沒有ZmDDM1A基因之間進(jìn)行比較。使用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
C. 野生型基因mCHH的Metagene圖譜。所有表達(dá)基因根據(jù)m6A修飾和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）被分為4類。在有或沒有ZmDDM1B基因之間進(jìn)行比較。使用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
（7）ZmDDM1變化對(duì)ZmMTA相關(guān)活性沒有影響
B. 野生型和zmddm1突變體中ZmMTA蛋白豐度的Western blot分析。
C. 野生型和zmddm1突變體中的ZmMTA蛋白免疫定位分析。Bars=5μm。
D. LC-MS/MS分析顯示野生型和zmddm1突變體中的整體mRNA m6A豐度。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。使用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
E. 野生型和zmddm1突變體中m6A位點(diǎn)沿標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄本分布的Metagene圖譜。
F. 餅圖描繪野生型（左）和zmddm1突變體（右）中非重疊轉(zhuǎn)錄本片段中的m6A peaks分布。
研究小結(jié)
本研究通過MeRIP-seq和BS-seq的綜合分析揭示了m6A和5mC之間的全基因組關(guān)聯(lián)，并表明了RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶ZmMTA與染色質(zhì)重塑因子ZmDDM1相互作用，并可能促進(jìn)其靶向TSS。本研究揭示了m6A和5mC之間的相互作用，并表明RNA修飾信息從RNA直接傳遞至DNA，以調(diào)控復(fù)雜的表觀基因組。考慮到m6A和5mC在介導(dǎo)基因表達(dá)中的廣泛作用，這種動(dòng)態(tài)變化可能在許多細(xì)胞環(huán)境中具有重要的調(diào)控功能。
參考文獻(xiàn)：
Luo JH, Guo T, Wang M, Liu JH, Zheng LM, He Y. RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development. Plant Physiol. 2023 Nov 23. pii: 7444906. doi: 10.1093/plphys/kiad625. PubMed PMID: 37995374.
2023年11月23日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賀巖教授課題組以“RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development“為題在《Plant Physiol》雜志發(fā)表研究論文，研究揭示了玉米（Zea mays）籽粒發(fā)育過程中m6A和5mC之間的密切關(guān)系，至少部分歸因于ZmMTA（Zea mays MTA，m6A關(guān)鍵參與因子）和ZmDDM1（5mC關(guān)鍵參與分子）之間的相互作用，且RNA修飾和DNA甲基化之間的互作可能在植物中保守。
標(biāo)題：RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development（RNA m6A修飾促進(jìn)玉米籽粒發(fā)育過程中的DNA甲基化）
期刊：Plant Physiology
影響因子：IF 7.4/ 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq（m6A-seq）、BS-seq、RNA-seq等
研究摘要：
本研究通過m6A-seq和BS-seq等分析揭示了玉米（Zea mays）中m6A和5mC之間通過mRNA腺苷甲基化酶（ZmMTA）（m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的關(guān)鍵因子）與DNA甲基化1（ZmDDM1）（調(diào)控DNA甲基化的關(guān)鍵染色質(zhì)重塑因子）減少之間的相互作用而發(fā)生串?dāng)_。與無m6A修飾的基因相比，帶有m6A修飾的基因具有更高水平的DNA甲基化。ZmMTA功能喪失導(dǎo)致玉米胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育過程中嚴(yán)重停滯，導(dǎo)致m6A修飾基因5'區(qū)CHH甲基化顯著降低。而ZmDDM1功能喪失對(duì)ZmMTA相關(guān)活性沒有明顯影響。這項(xiàng)研究在玉米籽粒發(fā)育過程中建立了m6A和5mC之間的直接聯(lián)系，并提供了RNA修飾和DNA甲基化之間相互作用的見解。
研究結(jié)果
（1）RNA m6A修飾與DNA甲基化之間的相互作用
圖1：m6A修飾和DNA甲基化的協(xié)作。
B. 不同m6A強(qiáng)度的基因的DNA甲基化譜。所有m6A修飾基因根據(jù)m6A強(qiáng)度從高到低分為3組，分別用紅色、藍(lán)色和黑色表示。將具有高水平和中等水平m6A修飾基因分別與具有中等水平和低水平m6A修飾的基因進(jìn)行比較。每組基因n=2490。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
（2）ZmMTA在玉米胚乳發(fā)生和胚乳發(fā)育中的作用
圖2：ZmMTA功能喪失嚴(yán)重阻礙了玉米的胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育。
B. zmmta-1/+在14 DAP（左）和成熟期（右）的自交穗。代表性的突變核用紅色箭頭表示。對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)字提取以進(jìn)行比較。Bar=1 cm。
C. 4~14 DAP野生型和zmmta-1突變體核的石蠟切片。這些切片用堿性品紅染色。Bars=1 mm。
D. 突變位點(diǎn)的野生型和zmmta-1突變體進(jìn)行Sanger測序。
E. Western blot檢測野生型和ZmMTA-1突變體核中ZmMTA蛋白的表達(dá)。
F. 野生型和zmmta-1突變體在14 DAP時(shí)的流式細(xì)胞術(shù)圖譜。C值顯示在每個(gè)peak頂部。
G. LC-MS/MS分析顯示野生型和zmmta-1突變體的總mRNA m6A豐度。數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)。
（3）zmmta功能喪失影響大量基因的表達(dá)和胚胎發(fā)育
圖3：野生型和zmmta-1突變體中轉(zhuǎn)錄組比較分析。
C. zmmta-1胚胎中下調(diào)（上）或上調(diào)（下）DEG的GO富集分析。圓圈的大小表示DEG的數(shù)量。顏色表示每個(gè)GO項(xiàng)的-log 10（P值）。
（4）ZmMTA對(duì)于m6A修飾基因的5'區(qū)域的mCHH是必需的
圖4：ZmMTA促進(jìn)m6A修飾基因5'區(qū)的mCHH。
B） 野生型和zmmta-1突變體中帶有或不帶有m6A修飾的基因中DNA甲基化（CG，CHG和CHH）的宏基因譜。野生型和zmmta-1突變體中m6A+的n=7472，m6A-的n=12844。使用野生型和zmmta-1突變體之間的雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。
（5）ZmMTA與ZmDDM1的相互作用
圖5：ZmMTA與ZmDDM1相互作用。
A） ZmMTA和ZmDDM1的Co-IP（共免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)。野生型ZmDDM1 的IP產(chǎn)物中檢測到ZmMTA，但未從ZmDDM1突變體中檢測到。同樣，在野生型的ZmMTA-IP產(chǎn)物中檢測到ZmDDM1，但未從ZmMTA-1突變體中檢測到。B） Y2H（酵母雙雜交）實(shí)驗(yàn)顯示ZmMTA與ZmDDM1A或ZmDDM1 B的相互作用。AD表示GAL4激活域；BD表示GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。使用空的pGADT7和pGBKT7載體之間的相互作用作為陰性對(duì)照。
C） LCI（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）實(shí)驗(yàn)顯示N.benthamiana葉片中ZmMTA與ZmDDM1A或ZmDDM1B的相互作用。左上部分顯示互作信號(hào)；其他3個(gè)部分顯示陰性對(duì)照信號(hào)。每個(gè)部分旁邊的標(biāo)簽表示特定的組合。熒光信號(hào)強(qiáng)度表示相互作用活性。
（6）RNA m6A修飾促進(jìn)ZmDDM1靶向TSS
圖6：m6A促進(jìn)ZmDDM1與TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）的結(jié)合
A. 餅圖描繪了ZmDDM1A和ZmDDM1 B在帶有或不帶有m6A修飾基因的5個(gè)片段的peaks分布。ZmDDM1-occupied基因是指具有ZmDDM1 peaks基因，而ZmDDM1-unoccupied基因指沒有ZmDDM2 peaks的基因。B. 野生型ZmDDM1占比Metaplots圖�；趍6A修飾和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）占比情況將所有表達(dá)的基因分為4類。在有或沒有ZmDDM1A基因之間進(jìn)行比較。使用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
C. 野生型基因mCHH的Metagene圖譜。所有表達(dá)基因根據(jù)m6A修飾和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）被分為4類。在有或沒有ZmDDM1B基因之間進(jìn)行比較。使用雙側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
（7）ZmDDM1變化對(duì)ZmMTA相關(guān)活性沒有影響
圖7：ZmDDM1對(duì)ZmMTA相關(guān)活性沒有影響。
A. 野生型和zmddm1突變體中ZmMTA轉(zhuǎn)錄本豐度的RT-qPCR分析。數(shù)據(jù)代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。使用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。B. 野生型和zmddm1突變體中ZmMTA蛋白豐度的Western blot分析。
C. 野生型和zmddm1突變體中的ZmMTA蛋白免疫定位分析。Bars=5μm。
D. LC-MS/MS分析顯示野生型和zmddm1突變體中的整體mRNA m6A豐度。數(shù)據(jù)代表三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD。使用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
E. 野生型和zmddm1突變體中m6A位點(diǎn)沿標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄本分布的Metagene圖譜。
F. 餅圖描繪野生型（左）和zmddm1突變體（右）中非重疊轉(zhuǎn)錄本片段中的m6A peaks分布。
研究小結(jié)
本研究通過MeRIP-seq和BS-seq的綜合分析揭示了m6A和5mC之間的全基因組關(guān)聯(lián)，并表明了RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶ZmMTA與染色質(zhì)重塑因子ZmDDM1相互作用，并可能促進(jìn)其靶向TSS。本研究揭示了m6A和5mC之間的相互作用，并表明RNA修飾信息從RNA直接傳遞至DNA，以調(diào)控復(fù)雜的表觀基因組。考慮到m6A和5mC在介導(dǎo)基因表達(dá)中的廣泛作用，這種動(dòng)態(tài)變化可能在許多細(xì)胞環(huán)境中具有重要的調(diào)控功能。
參考文獻(xiàn)：
Luo JH, Guo T, Wang M, Liu JH, Zheng LM, He Y. RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development. Plant Physiol. 2023 Nov 23. pii: 7444906. doi: 10.1093/plphys/kiad625. PubMed PMID: 37995374.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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