由于全球的老齡化趨勢(shì)加劇，神經(jīng)退行性疾病 (NDDs) 的患病風(fēng)險(xiǎn)逐漸升高，對(duì) NDDs 病理靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及確認(rèn)更是挑戰(zhàn)滿滿。高通量篩選技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病中的大量應(yīng)用無疑加快了相關(guān)藥物的開發(fā)速度。今天我們就一起來了解一下吧~

 Tips：
高通量篩選利用自動(dòng)化系統(tǒng)能夠同時(shí)測(cè)試數(shù)千至數(shù)百萬個(gè)樣品，可在模型生物、細(xì)胞、或分子水平上驗(yàn)證生物活性，篩選已知結(jié)構(gòu)的小分子化合物、化學(xué)混合物、天然產(chǎn)物、寡核苷酸和抗體等等。

本期由小 M 帶著大家一起從 NDDs 的病理標(biāo)志出發(fā)，學(xué)習(xí)一下高通量篩選在神經(jīng)退行性疾病研究中的一些實(shí)例吧！



據(jù) Wilson DM 3rd 在 Cell 上發(fā)表的綜述“Hallmarks of neurodegenerative diseases ”報(bào)道，NDDs 的標(biāo)志主要分為八大類：病理性蛋白的聚集、突觸和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)功能障礙、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡、神經(jīng)元細(xì)胞骨架異常、能量穩(wěn)態(tài)失衡、脫氧核糖核酸和核糖核酸缺陷、炎癥、神經(jīng)元細(xì)胞死亡[1]。而這些標(biāo)志也是開發(fā) NDDs 相關(guān)藥物的重要著手點(diǎn)。本期小 M 為大家主要介紹 NDDs 的其中三大病理標(biāo)志。

圖 2. AlphaLISA 和 HTRF 法檢測(cè) Tau 蛋白含量^[2]。 

(A) tau 蛋白測(cè)定的分步程序。將 SH-SY5Y 細(xì)胞接種在測(cè)定板中并孵育 4 小時(shí)，然后添加化合物。與化合物一起孵育 3 天后，裂解細(xì)胞并添加檢測(cè)試劑 (AlphaLISA 或 HTRF)。孵育 2 小時(shí)后，使用讀板器捕獲信號(hào)。(B) AlphaLISA tau 測(cè)定原理圖示。(C) HTRF 測(cè)定原理圖示。

多種神經(jīng)退行性疾病中有毒蛋白聚集體的積累與自噬-溶酶體途徑（Autophagy-Lysosome Pathway, ALP，真核細(xì)胞中維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的途徑之一）的缺陷有關(guān)，通過調(diào)節(jié)溶酶體功能的主調(diào)節(jié)因子 TFEB 可以改善多種神經(jīng)退行性疾病模型的疾病表型。

圖 3. 高通量篩選 TFEB 和 TFE3 的激酶調(diào)節(jié)因子^[3]。 

(A) 在所有測(cè)定中以 1 µM 篩選 490 種 PKIS2 化合物，并通過級(jí)聯(lián)分析來鑒定無毒化合物。(B) AK 釋放和 (C) 免疫細(xì)胞化學(xué)圖像的核計(jì)數(shù)用于評(píng)估細(xì)胞毒性。(D) 活性溶酶體計(jì)數(shù)和 (E) 通過 DQ Red BSA 測(cè)定測(cè)量的校正熒光強(qiáng)度用于評(píng)估溶酶體毒性。對(duì)于 (F) 核 TFEB (% nTFEB) 和/或 (G) 核 TFE3 (% nTFE3) 易位�？偣泊_定了 74 個(gè)陽性命中。

初篩時(shí)，作者使用 AK 含量測(cè)定發(fā)光試劑盒檢測(cè)了化合物 (1 μM) 對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC) 中腺苷酸激酶 (Adenylate kinase, AK) 含量變化 (圖 3 B,C)，通過 DQ™ Red BSA 試劑檢測(cè)溶酶體活性情況 (圖 3 D,E)。根據(jù) AK 含量和溶酶體活性結(jié)果，作者剔除了能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或線粒體毒性的化合物。
復(fù)篩時(shí)，作者使用免疫細(xì)胞化學(xué)法 (ICC) 測(cè)定了不同化合物 (0.01-2 μM) 對(duì) TFEB 和 TFE3 入核情況的影響 (圖 3 F,G)，篩選出了 74 種能夠顯著促進(jìn) TFEB 或 TFE3 入核的化合物[3]。



神經(jīng)元是一類對(duì)能量要求比較高的活躍細(xì)胞，能量代謝的紊亂會(huì)極大程度的影響神經(jīng)元的正常功能，導(dǎo)致 NDDs 疾病的發(fā)生。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 是能量代謝過程中的一種重要輔酶，在維持神經(jīng)元健康中發(fā)揮重要作用。

▐  靶向 NAMPT 的小分子激活劑篩選
Hong Yao 等人根據(jù) NAD 代謝調(diào)控神經(jīng)退行性疾病這一科學(xué)熱點(diǎn)，通過高通量篩選和基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)，篩選出了靶向NAMPT (Nicotinamide Phosphoribosyl Transferase, 煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，是 NAD 合成的一大關(guān)鍵限速酶) 的小分子激活劑 (NAT)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 NAT 能夠通過促進(jìn) NAD 的生物合成，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。

圖 4. 高通量篩選鑒定一種新的NAMPT 激活劑^[4]。 

(A) 高通量篩選 NAMPT 激動(dòng)劑的程序示意圖。(B) 三偶聯(lián)的 NAMPT 酶反應(yīng)在室溫下用 DMSO 或 10 μM 的 NAT 進(jìn)行 20 分鐘，開始時(shí)加入或不加入 NAM。(C) 在指定濃度的 NAT 或 NAT-5r 存在下進(jìn)行 NMNAT1 酶測(cè)定。

這次小 M 從 NDDs 的病理特征出發(fā)，列舉了三個(gè)高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)藥物篩選的實(shí)例，生動(dòng)的講述了高通量篩選技術(shù)從理論到實(shí)際操作的一個(gè)運(yùn)用，各位小伙伴們學(xué)會(huì)了嘛~