圖1 PCL單細(xì)胞圖譜

2. 細(xì)胞模塊分析揭示了5種TIME亞型
為了研究PLC的TIME亞型，作者檢測(cè)了腫瘤組織細(xì)胞的共富集模式。層次聚類識(shí)別出5個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞模塊(CM1-CM5)(圖2a)，作者將患者分為5個(gè)相應(yīng)的TIME亞型(圖2b-e)，并從以下4個(gè)方面對(duì)每個(gè)亞型做了具體分析:(1)細(xì)胞組成，(2)功能標(biāo)記基因表達(dá)，(3)時(shí)間相關(guān)基因特征，(4)預(yù)后相關(guān)性。

CM1中含有活化的骨髓細(xì)胞和T細(xì)胞簇，CM1優(yōu)勢(shì)患者表現(xiàn)出免疫激活狀態(tài)，因此被指定為TIME-IA(免疫激活)。CM2中與免疫抑制富集的“骨髓細(xì)胞免疫抑制”和“促腫瘤細(xì)胞因子”特征有關(guān)，并且與較差的預(yù)后相關(guān)，被指定為TIME-ISM(免疫抑制髓系)。基質(zhì)細(xì)胞均在CM3和CM4中富集。CM3中高表達(dá)腫瘤激活的基質(zhì)基因，預(yù)后較差，指定為TIME-ISS(免疫抑制基質(zhì))。而CM4含有大量?jī)?nèi)皮和間充質(zhì)細(xì)胞，缺乏免疫細(xì)胞，被命名為免疫排斥表型(TIME-IE)。CM5含有肝駐留細(xì)胞簇，包括駐留型自然殺傷細(xì)胞(NK_05_CD160) Kupffer細(xì)胞(Mph_01_MARCO)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(EC_01_CLEC4A)，與較好的預(yù)后相關(guān)。因此，CM5優(yōu)勢(shì)患者被指定為TIME-IR(免疫駐留)。這些TIME亞型表現(xiàn)出不同的趨化因子網(wǎng)絡(luò)，并與腫瘤細(xì)胞的不同體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)錄組譜相關(guān)。

作者將以上分類方案命名為TIMELASER，用于區(qū)分腫瘤免疫微環(huán)境亞型。將這種分類方法應(yīng)用于空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和已發(fā)表的scRNA-seq、bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集，均能得到與本文相似的TIME亞型。這些結(jié)果驗(yàn)證了本文提出的TIMELASER分類法，并進(jìn)一步證明該分類法在空間分辨率和bulkRNA數(shù)據(jù)分析上的有效性。
 

圖2解析PCL的5種TIME亞型

3. 肝癌中性粒細(xì)胞異質(zhì)性
由于中性粒細(xì)胞比較脆弱，基因含量少，單細(xì)胞測(cè)序中難以捕獲，而TIME-ISM（CM2）中多種中性粒細(xì)胞亞群的富集、與不良預(yù)后的關(guān)聯(lián)促使作者進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞。34,307個(gè)中性粒細(xì)胞被分為11個(gè)亞群，這些亞群表現(xiàn)出明確的組織分離和癌癥類型偏好，主要可分為外周血中性粒細(xì)胞(PBNs)、鄰近肝臟中性粒細(xì)胞(ALNs)、腫瘤中富集的中性粒細(xì)胞（TANs）。擬時(shí)序分析揭示了中性粒細(xì)胞從PBN到ALN再到TAN的明確分化路徑(圖3a)。

值得注意的是，TIME-ISM中三個(gè)TAN亞群的組合比例較高(Neu_09/10/11，平均占總TAN的86.8%)，與較差的預(yù)后相關(guān)，暗示這些TAN具有促腫瘤功能。作者重點(diǎn)關(guān)注了兩個(gè)TANs亞群Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1的表型和功能。通過(guò)mIHC證實(shí)，CCL4+ TANs (Neu_11_CCL4)高表達(dá)趨化因子相關(guān)基因CCL3和CCL4(圖3d)。一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TANs具有趨化因子分泌功能，支持CCL4+ TANs可以招募巨噬細(xì)胞的觀點(diǎn)。作者還發(fā)現(xiàn)，與非TANs相比，TANs中CD274(編碼PD-L1)的表達(dá)顯著增加，其中Neu_09_IFIT1的表達(dá)量最高(圖3i)。為了研究高PD-L1表達(dá)的TANs是否會(huì)直接抑制T細(xì)胞活性，作者將CD8+ T細(xì)胞與體外誘導(dǎo)的TANs或患者衍生的TANs共培養(yǎng)。與體外誘導(dǎo)的TANs共培養(yǎng)的CD8+ T細(xì)胞中，T細(xì)胞細(xì)胞毒性標(biāo)記物IFNγ和活化標(biāo)記物CD25和CD69的蛋白水平降低(圖3n)。在加入抗PD-L1抗體后， IFNγ的下降被逆轉(zhuǎn)(圖3o)，證實(shí)PD-L1介導(dǎo)了TANs的抑制功能。
 

圖3中性粒細(xì)胞異質(zhì)性

4. 人類和小鼠肝癌中的保守中性粒細(xì)胞亞群
為了進(jìn)一步研究TANs的異質(zhì)性，作者建立了兩種新的自發(fā)性肝癌小鼠模型，pTMC小鼠主要發(fā)展為HCC, pTMK小鼠主要發(fā)展為ICC。作者對(duì)來(lái)自6只小鼠的21個(gè)樣本進(jìn)行了scRNA-seq分析，包括外周血、腫瘤鄰近肝臟和腫瘤。17,780個(gè)中性粒細(xì)胞被分為12個(gè)簇，顯示出明確的組織特異性和有序的發(fā)育軌跡(圖4a、b)。TIME-ISM (hNeu_09/10/11)中的三個(gè)TAN子集分別對(duì)應(yīng)于mNeu_10/11/12。Cd274在小鼠TANs高表達(dá)，與人類TANs一致(圖4d)。通過(guò)無(wú)偏倚的整合跨物種數(shù)據(jù)，分析關(guān)鍵特征基因，作者發(fā)現(xiàn)小鼠和人的中性粒細(xì)胞在很大程度上保守(圖4c)，這一發(fā)現(xiàn)為在小鼠模型中研究中性粒細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療奠定了基礎(chǔ)。
 

圖4 小鼠模型中的中性粒細(xì)胞異質(zhì)性

5. 中性粒細(xì)胞耗竭延緩腫瘤生長(zhǎng)
由于TIME-ISM TANs的促腫瘤表型(Neu_09/10/11)，作者進(jìn)一步探究了在體內(nèi)消除這些促腫瘤TANs亞群的治療效果。使用抗ly6g抗體消耗中性粒細(xì)胞后，患癌小鼠的肝癌結(jié)節(jié)和腫瘤重量顯著減少(圖4e,f)。與同型對(duì)照相比，抗ly6g處理后的TANs數(shù)量和TANs的PD-L1表達(dá)均下降(圖4)。此外，作者觀察到浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞減少46.6%。雖然Ly6G阻斷并沒(méi)有改變CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量，但它們的衰竭狀態(tài)得到了緩解�？偟膩�(lái)說(shuō)，中性粒細(xì)胞耗竭可以減弱巨噬細(xì)胞募集和T細(xì)胞抑制，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

結(jié)論
本研究通過(guò)大規(guī)模，免分選的單細(xì)胞分析全面描繪了PLC的細(xì)胞圖譜，識(shí)別到五種TIME亞型，解析了中性粒細(xì)胞異質(zhì)性。TIMELASER框架涵蓋了大多數(shù)細(xì)胞群，可對(duì)TIME亞型無(wú)偏分類。作者推測(cè)，對(duì)這些數(shù)據(jù)的深入分析，將為腫瘤- TIME和TIME-TIME串?dāng)_提供新的見解，有助于識(shí)別免疫細(xì)胞功能，指導(dǎo)我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)PCL的生物標(biāo)志物或免疫治療靶點(diǎn)。本文深入研究了中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性及其功能，確定了人類和小鼠之間廣泛保守的中性粒細(xì)胞譜。TANs具有促腫瘤作用，作者推測(cè)CCL4+、SPP1+和PD-L1+ TANs是有希望的免疫治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步探索中性粒細(xì)胞對(duì)免疫治療的影響及其相關(guān)的臨床混雜因素，將為更好地了解TAN生物學(xué)特性，提出肝癌治療的轉(zhuǎn)化研究途徑提供新的機(jī)會(huì)。

參考文獻(xiàn)：
[1] Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al (2022) Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature 612:141–147. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x