cfDNA甲基化在器官和組織損傷檢測(cè)中的應(yīng)用
檢測(cè)器官和組織損傷對(duì)于早期診斷、治療決策和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展至關(guān)重要。由于DNA甲基化模式可以響應(yīng)組織損傷而改變，甲基化檢測(cè)提供了一種有前途的方法，在早篩早診、疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)、治療效果和器官移植評(píng)估等可行性方面具有潛在應(yīng)用。組織或器官損傷后釋放到血流中的cfDNA（cell-free DNA）可以作為損傷的生物標(biāo)志物。cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)（包括DNA甲基化模式）可以提供對(duì)組織和器官損傷程度的見(jiàn)解。本文強(qiáng)調(diào)DNA甲基化作為一種廣泛研究的表觀遺傳修飾，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和疾病發(fā)展等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。介紹了多種高度精確的5-mC甲基化檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)是獲得與組織損傷相關(guān)表觀遺傳改變的深刻見(jiàn)解的有力工具。深入研究了器官和組織損傷中DNA甲基化變化的潛在機(jī)制，包括炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機(jī)制。介紹了cfDNA甲基化在檢測(cè)特定器官組織和器官損傷中的研究現(xiàn)狀。最后概述了在臨床試驗(yàn)中鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記中的多個(gè)步驟。本綜述將探討基于cfDNA甲基化的檢測(cè)器官和組織損傷的機(jī)制和研究現(xiàn)狀，潛在機(jī)制以及在臨床實(shí)踐中的潛在應(yīng)用。
Introduction
檢測(cè)器官和組織損傷對(duì)于及時(shí)診斷和有效治療各種疾病和病癥至關(guān)重要。早期發(fā)現(xiàn)組織損傷可以及時(shí)干預(yù)，防止進(jìn)一步的損傷并可能改善預(yù)后。監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展也可以幫助告知治療決策，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。此外，評(píng)估治療效果可以幫助確定干預(yù)措施是否有效，并為繼續(xù)或修改治療計(jì)劃的決定提供信息。最后，在移植醫(yī)學(xué)中，檢測(cè)組織損傷對(duì)于評(píng)估移植器官的生存能力和確保受體成功結(jié)果至關(guān)重要。在此前研究中，組織切片的組織病理學(xué)檢查通常被認(rèn)為是檢測(cè)組織和器官損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，這種方法是高度侵入性的，不適用于組織和器官損傷的早期篩查。
CpG位點(diǎn)是DNA上的特定區(qū)域，以C（胞嘧啶）和鳥嘌呤核苷酸命名，通過(guò)磷酸二酯鍵連接。這些位點(diǎn)廣泛分布于整個(gè)人類基因組中，對(duì)基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。在許多研究中，CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化也因組織損傷而變化�；诩谆臋z測(cè)為檢測(cè)器官和組織損傷提供了一種有前途的方法。基于DNA甲基化模式的表觀遺傳分析包括DNA甲基化模式的研究，以檢測(cè)可能反映組織損傷或疾病相關(guān)變化的跡象。這些測(cè)試方法具有高度的特異性和靈敏度，可應(yīng)用于各種樣本類型，包括血液、尿液和組織活檢，促進(jìn)非侵入性數(shù)據(jù)收集，并大大推進(jìn)組織損傷的早期診斷�；诩谆臋z測(cè)方法正在研究一系列應(yīng)用，從早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展到評(píng)估治療效果和評(píng)估移植器官活力。
液體活檢，特別是血漿中循環(huán)cfDNA甲基化分析，可能成為組織損傷檢測(cè)中一種有前途的非侵入性診斷方法。血液或體液樣本的收集是一種非侵入性程序，不需要組織切除或組織活檢，從而避免了傳統(tǒng)組織檢查的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)。大多數(shù)cfDNA片段的范圍為80-200 bp，長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)于核小體大小160-180 bp。起源組織解卷積是cfDNA甲基化分析中的關(guān)鍵技術(shù)，使研究人員能夠根據(jù)DNA甲基化模式確定cfDNA來(lái)源。該技術(shù)基于一個(gè)核心概念：不同的組織和器官在其DNA甲基化譜中具有獨(dú)特的表觀遺傳特征。因此，當(dāng)這些組織或器官受損時(shí)，例如由于癌癥、創(chuàng)傷或其他導(dǎo)致細(xì)胞死亡的疾病，它們會(huì)將cfDNA釋放到血液中（圖1A）。研究人員可以分析這些cfDNA樣本中的DNA甲基化模式，并嘗試將其與已知組織特異性DNA甲基化模式的參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。通過(guò)這種比較，他們可以解卷積或確定給定cfDNA樣品來(lái)源組織或器官。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠以非侵入性方式檢測(cè)和監(jiān)測(cè)組織特異性損傷，而不需要傳統(tǒng)的組織活檢。
如圖1B所示，組織和器官損傷后cfDNA形式的表觀遺傳標(biāo)記物釋放到血流中，使cfDNA成為評(píng)估組織和器官損傷的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)，包括DNA高甲基化和低甲基化模式，可以提供對(duì)組織和器官損傷程度的見(jiàn)解�？傮w而言，cfDNA的DNA甲基化狀態(tài)可用作組織和器官損傷的生物標(biāo)志物。本文將研究cfDNA甲基化涉及的潛在機(jī)制，用于檢測(cè)器官和組織損傷的cfDNA甲基化模式的當(dāng)前研究現(xiàn)狀，以及這些檢測(cè)在臨床實(shí)踐中的潛在應(yīng)用。
表觀遺傳學(xué)和DNA甲基化
即使DNA序列保持不變，真核基因表達(dá)也通過(guò)多種機(jī)制受復(fù)雜調(diào)控，這種現(xiàn)象被稱為表觀遺傳學(xué)。表觀遺傳調(diào)控涉及多種機(jī)制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。其中DNA甲基化研究非常廣泛。
在真核生物中，DNA甲基化涉及在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在DNA中C的第5個(gè)碳上添加一個(gè)甲基，產(chǎn)生了5-mC（5-甲基胞嘧啶），主要位于CpG位點(diǎn)。人類基因組中約有2.8M的CpG位點(diǎn)，但其分布并不均勻。CpG序列平均僅發(fā)生約1%，CGI（CpG島）是密集的區(qū)域，其頻率是平均頻率的五倍以上，通常定義為超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的基因組區(qū)域，GC含量超過(guò)50%，CpG比率超過(guò)60%。超過(guò)60%的基因，包括具有組織特異性表達(dá)模式的基因，在其啟動(dòng)子區(qū)域和第一外顯子中具有CpG島。
在正常組織基因組中，約70%的CpG位點(diǎn)被甲基化，而大多數(shù)CpG島未甲基化。一些CGI基因被甲基化，如非活性X染色體上的基因和印跡基因。甲基化在各種生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、X染色體失活、基因組印跡、基因沉默、防御外源基因以及多細(xì)胞生物中的異生素代謝。
表觀遺傳機(jī)制的研究在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)中具有巨大意義，增強(qiáng)了對(duì)基因調(diào)控、疾病發(fā)生和遺傳以及創(chuàng)新療法發(fā)展的理解。
DNA甲基化在器官和組織損傷中的變化機(jī)制
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是一類在細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的酶，可以調(diào)控DNA甲基化。DNMT主要負(fù)責(zé)向DNA中的胞嘧啶殘基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)DNA甲基化。DNMT能夠與DNA結(jié)合并識(shí)別靶DNA序列，通常是CpG。一旦DNMT與靶DNA序列結(jié)合，它們就會(huì)將甲基從SAM供體轉(zhuǎn)移到DNA中的胞嘧啶堿基。該過(guò)程涉及形成共價(jià)鍵，將甲基添加到胞嘧啶堿基的第五個(gè)碳原子上，產(chǎn)生5-mC。DNMT1（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1）作為維持DNMT，主要任務(wù)是在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂過(guò)程中維持DNA甲基化穩(wěn)定性。DNMT1可以識(shí)別新合成的未甲基化DNA鏈，并在DNA復(fù)制過(guò)程中添加甲基，以確保每一代細(xì)胞中DNA甲基化模式的正確遺傳。
DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中引入新的DNA甲基化。這些酶可以將甲基引入特定基因或基因組區(qū)域，從而調(diào)控基因表達(dá)并影響細(xì)胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵組成部分。TET酶可以從DNA中去除甲基，將5-mC轉(zhuǎn)化為5hmC（5-羥甲基胞嘧啶），并參與DNA去甲基化過(guò)程。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶）和AB（Apobec）是脫氨酶，通常與DNA堿基脫氨和脫氧核糖修飾有關(guān)，而不是直接參與DNA甲基化或去甲基化反應(yīng)。它們?cè)诟淖僁NA堿基方面起作用，例如將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而不涉及DNA甲基的添加或去除。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是與DNA修復(fù)相關(guān)的兩種酶，在維持DNA堿基的完整性和糾正DNA堿基錯(cuò)誤方面起著至關(guān)重要的作用。這些酶向DNA分子引入脫氨或脫氧核糖基化等變化，影響DNA甲基化狀態(tài)。組織和器官損傷可以通過(guò)各種機(jī)制調(diào)控DNMT和DNA去甲基化酶，從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機(jī)制。這些機(jī)制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的復(fù)雜變化，并導(dǎo)致?lián)p傷和疾病的持續(xù)（圖2）。
圖2：器官和組織損傷中的DNA甲基化和去甲基化機(jī)制。組織和器官損傷可以通過(guò)各種機(jī)制調(diào)控DNMT和DNA去甲基化酶（如TET和TDG），從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機(jī)制
炎癥
在組織和器官損傷后，身體啟動(dòng)炎癥反應(yīng)以清除受損的細(xì)胞和組織，促進(jìn)修復(fù)和再生。然而，這種炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致DNA甲基化變化，因?yàn)檠装Y反應(yīng)可以產(chǎn)生活性氧（ROS），亞硝酸鹽和其他可能直接或間接影響DNA甲基化的有害物質(zhì)。炎癥還可以激活免疫細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子和其他信號(hào)分子的分泌，從而改變DNA甲基化模式。例如，IL-6（細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6）和STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）已被證明可增加DNMT活性，從而導(dǎo)致某些基因的DNA甲基化增加。過(guò)量的IL-15（細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-15）在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)DNMT3b（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3b）上調(diào)和整體DNA高甲基化。
氧化應(yīng)激
由于受損細(xì)胞釋放的自由基、過(guò)氧化物和其他氧化劑，組織和器官損傷可能會(huì)增加細(xì)胞氧化應(yīng)激，可能會(huì)破壞DNA并改變調(diào)控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致DNMT氧化，導(dǎo)致活性改變和DNA甲基化模式改變。在最近對(duì)Graves病患者外周血單核細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)活性氧增加導(dǎo)致DNMT1表達(dá)增加，反過(guò)來(lái)又與促進(jìn)Graves病自身免疫的免疫調(diào)控基因異常甲基化模式有關(guān)。類似地，在多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性的研究中，多柔比星誘導(dǎo)心臟細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生自由基和一氧化氮以響應(yīng)應(yīng)激。氧化應(yīng)激增加并下調(diào)DNMT1酶活性，導(dǎo)致DNA甲基化的線粒體功能障礙。氧化應(yīng)激還可以改變從DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，從而導(dǎo)致DNA甲基化模式變化。在多囊卵巢綜合征疾病研究中構(gòu)建的細(xì)胞損傷模型中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷降低了TET水平并導(dǎo)致細(xì)胞甲基化水平升高。
DNA損傷修復(fù)
DNA損傷是組織和器官損傷的常見(jiàn)后果，DNA修復(fù)機(jī)制被激活以修復(fù)損傷。DNA修復(fù)過(guò)程可以影響DNA甲基化模式，因?yàn)橐恍〥NA修復(fù)酶可以改變DNA甲基化水平。例如，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一種參與DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的核酶（nuclear enzyme），可以催化甲基全基因組染色質(zhì)去除。PARP1與染色質(zhì)全基因組的結(jié)合與DNA甲基化模式互斥，表明PARP1與DNA甲基化之間存在功能互作。事實(shí)上，抑制PARylation會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化模式的全基因組變化。DNA雙加氧酶AlkB也可以調(diào)控DNA甲基化水平，AlkB可以通過(guò)在Fe（II）離子，α-KG和氧氣存在下的氧化去甲基化機(jī)制將m3C和m1A直接轉(zhuǎn)化為未甲基化堿基。在一項(xiàng)血液疾病研究中，生發(fā)中心的B細(xì)胞在DNMT1幫助下分化，改變其DNA模式以正確分化。DNMT1在DNA甲基化和雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮雙重作用。
總之，組織和器官損傷可以通過(guò)多種機(jī)制引起DNA甲基化模式變化，這些機(jī)制可以互作以產(chǎn)生DNA甲基化模式的復(fù)雜變化。
5-mC甲基化檢測(cè)技術(shù)
研究人員利用各種DNA甲基化檢測(cè)方法研究cfDNA中的甲基化，從而了解健康和疾病狀態(tài)下的甲基化變化。這些方法主要包括一系列5-mC甲基化檢測(cè)，可分為以下幾類：
非測(cè)序的甲基化檢測(cè)方法
非測(cè)序甲基化檢測(cè)方法通常不涉及DNA測(cè)序，而是依賴各種化學(xué)或生物技術(shù)來(lái)分析DNA甲基化狀態(tài)。這些方法包括限制性酶消化，包括使用甲基化敏感酶在特定核苷酸序列切割DNA，從而可以研究DNA甲基化。例如，von Kanel等人結(jié)合限制性內(nèi)切酶消化和實(shí)時(shí)PCR或Xianfeng Wang等人基于CRISPR/Cas13a的策略等方法能夠精確評(píng)估單個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)和拷貝數(shù)變化。此外，MSP（甲基化特異性PCR）和其他使用亞硫酸鹽處理的DNA模板的基于PCR的方法是分析特定位點(diǎn)DNA甲基化的靈敏和特異性技術(shù)，MSP使用甲基化特異性引物選擇性擴(kuò)增甲基化或未甲基化的DNA序列。這些方法，包括TaqMan實(shí)時(shí)FQ-MSP（TaqMan實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR）和ddPCR（數(shù)字液滴PCR），提供了高精度和靈敏度，使其成為研究DNA甲基化的有價(jià)值的工具。例如，MSP聯(lián)合ddPCR已被用于檢測(cè)原發(fā)性硬化性膽管炎患者的膽管癌標(biāo)志物。此外，HRM（高分辨率熔解）是一種基于甲基化和非甲基化DNA片段的不同熔解行為檢測(cè)DNA甲基化的方法。HRM允許對(duì)DNA甲基化進(jìn)行定性和定量分析，而不需要昂貴的測(cè)序技術(shù)，從而提供了一種廣泛用于DNA甲基化研究的快速，高通量和經(jīng)濟(jì)高效的方法。Wojdacz和Dobrovic的MS-HRM（甲基化靈敏的高分辨率熔解）方案可以檢測(cè)未甲基化中的甲基化panel，其靈敏度與MSP相當(dāng)。Lasse Kristensen等人還開(kāi)發(fā)了一種無(wú)探針定量MSP分析方法，使用HRM分析進(jìn)行可靠檢測(cè)，即使在0.1%甲基化標(biāo)準(zhǔn)下也是如此。此外，甲基化芯片如Illumina的HM450K（Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip）和850K（Illumina Infinium methylation EPIC Bead Chip）為全面的甲基化分析提供了具有成本效益和高通量的平臺(tái)，HM450K靶向人類基因組中超過(guò)485000個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，并被廣泛用于癌癥研究。較新的850K芯片擴(kuò)展了覆蓋范圍，包括針對(duì)調(diào)控區(qū)的其他探針，但這些陣列的全基因組覆蓋范圍有限，可能無(wú)法捕獲所有甲基化信息�，F(xiàn)已更新至935k芯片。
測(cè)序的甲基化檢測(cè)方法
基于測(cè)序的DNA甲基化檢測(cè)方法包括一系列用于研究DNA甲基化模式的技術(shù)。一種廣泛使用的方法是BSP（亞硫酸鹽測(cè)序PCR），它將PCR擴(kuò)增與Sanger測(cè)序相結(jié)合，以鑒定單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化位點(diǎn)。BSP有兩種形式：直接BSP，它直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，克隆BSP，它涉及將PCR產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序。然而BSP具有局限性，例如對(duì)低水平鑲嵌的靈敏度和潛在的PCR誘導(dǎo)的偏倚。
焦磷酸測(cè)序通過(guò)定量檢測(cè)核苷酸的摻入來(lái)實(shí)時(shí)高分辨率和靈敏地監(jiān)測(cè)DNA甲基化，這對(duì)于各種研究和臨床應(yīng)用都很有價(jià)值，包括癌癥預(yù)測(cè)和重復(fù)元素研究。
WGBS（全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序）提供了全面和高分辨率的全基因組甲基化信息，是甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它面臨著復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理和高測(cè)序要求等挑戰(zhàn)。另一方面，MCTA-seq（甲基化CpG串聯(lián)擴(kuò)增和測(cè)序）是一種靈敏的方法，能夠分析微小的基因組DNA量（低至7.5 pg），有望用于非侵襲性癌癥篩查。然而，與全基因組方法相比，它可能需要專門的設(shè)備，且覆蓋范圍有限。
靶向亞硫酸鹽測(cè)序（Target-seq）選擇性地?cái)U(kuò)增特定的基因組區(qū)域，將甲基化陣列的成本效益與亞硫酸鹽測(cè)序的數(shù)字信號(hào)相結(jié)合。可以針對(duì)特定的基因或區(qū)域進(jìn)行定制，但可能需要額外的時(shí)間和資源來(lái)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和合成。
RRBS（減少代表性亞硫酸鹽測(cè)序）是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，專注于CpG富集區(qū)域，并實(shí)現(xiàn)了scRRBS（單細(xì)胞RRBS）等進(jìn)步，為腫瘤負(fù)荷估計(jì)和疾病生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了見(jiàn)識(shí)。
MeDIP-Seq（甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序）減少了甲基化測(cè)序所需的DNA input，使其適用于cfDNA甲基化檢測(cè)。該方法的擴(kuò)展cfMeDIP-seq（cfDNA甲基化DNA免疫沉淀和高通量測(cè)序）可應(yīng)用于DNA可用性有限的各種樣品類型，可能將其應(yīng)用擴(kuò)展到癌癥檢測(cè)之外。
MBD-Seq（CpG甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域富集測(cè)序）使用MBD（甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域）蛋白選擇性捕獲甲基化DNA片段，有效鑒定和定量甲基化區(qū)域，特別是CpG和CGI富集區(qū)域。超低 input cfDNA甲基化分析方法cfMBD-seq（cfDNA-MBD-seq）優(yōu)化了用于各種樣品類型的MBD捕獲條件。
納米孔測(cè)序是一種革命性的技術(shù)，可直接檢測(cè)DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)的電流變化，從而實(shí)現(xiàn)直接甲基化檢測(cè)，而無(wú)需化學(xué)修飾。例如ONT（牛津納米孔技術(shù)）具有高通量、高分辨率和單分子測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，在包括癌癥檢測(cè)在內(nèi)的各種研究和臨床應(yīng)用中具有重要價(jià)值。然而它有局限性，包括單核苷酸變異和插入/缺失的每堿基成本和錯(cuò)誤率較高。
基于SMRT（單分子實(shí)時(shí)）技術(shù)的PacBio測(cè)序產(chǎn)生異常長(zhǎng)的DNA讀長(zhǎng)，使其適用于研究復(fù)雜的基因組，結(jié)構(gòu)變異，重復(fù)序列和重復(fù)元件的表觀遺傳變化。可以在沒(méi)有GC或AT含量偏好的情況下分析不同的基因組和DNA樣品。
cfDNA甲基化檢測(cè)特異性組織及器官損傷的研究現(xiàn)狀
基于cfDNA甲基化的檢測(cè)在檢測(cè)組織和器官損傷方面具有巨大潛力，該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究可以為各種組織和器官疾病提供新的診斷和預(yù)后工具。以下描述了cfDNA甲基化在檢測(cè)特定器官組織和器官損傷中的研究現(xiàn)狀（表1）。
表1：特定組織和器官損傷的cfDNA甲基化標(biāo)記
肝臟
基于肝源性cfDNA甲基化檢測(cè)方法已被用于檢測(cè)各種情況下的肝損傷，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝、肝細(xì)胞癌和肝移植。Miguel Waterhouse等人使用數(shù)字液滴PCR檢測(cè)cfDNA中PTK28基因特異性甲基化標(biāo)記，以檢測(cè)急性移植物抗宿主病患者的肝組織損傷。區(qū)分肝臟中aGvHD（急性移植物抗宿主病）和非aGvHD（非急性移植物抗宿主�。┑拈撝禐�1.5（靈敏度=0.928；特異性=0.910），肝損傷aGvHD的臨床改善導(dǎo)致甲基化PTK2B濃度降低。在另一項(xiàng)關(guān)于癌癥對(duì)宿主組織損害的研究中，發(fā)現(xiàn)受癌癥影響的器官中細(xì)胞死亡可以通過(guò)cfDNA組織特異性甲基化模式來(lái)檢測(cè)。在肝細(xì)胞癌研究中，通過(guò)Illumina Infinium 450k芯片鑒定了三種肝組織甲基化特異性標(biāo)志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。與健康供體、局部癌癥患者或非肝轉(zhuǎn)移性疾病患者相比，肝轉(zhuǎn)移患者表現(xiàn)出更高水平的肝細(xì)胞來(lái)源cfDNA，無(wú)論是通過(guò)肝細(xì)胞來(lái)源cfDNA比例或每毫升肝細(xì)胞基因組當(dāng)量來(lái)檢測(cè)。使用561（基因組當(dāng)量/mL）的肝源性特異性cfDNA標(biāo)記物，檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移和肝損傷的特異性和靈敏度分別為95%和35%。此外，肝細(xì)胞cfDNA水平能夠區(qū)分有無(wú)肝轉(zhuǎn)移的4期癌癥患者（AUC=0.81，95%置信區(qū)間0.73-0.89，P<0.0001）。另一項(xiàng)研究描述了一種通過(guò)基于攜帶肝細(xì)胞特異性甲基化模式的cfDNA片段的定量鑒定肝細(xì)胞中特異性非甲基化的三個(gè)基因組位點(diǎn)（ITIH4，IGF2R和VTN）來(lái)檢測(cè)急性肝細(xì)胞死亡的方法。通過(guò)ddPCR分析了來(lái)自健康個(gè)體、肝移植患者、肝臟供體、敗血癥患者和杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的血液樣本，結(jié)果表明，這三種肝細(xì)胞來(lái)源的cfDNA分析可以提供有關(guān)肝細(xì)胞死亡的特定和敏感信息。它提供了肝損傷的近實(shí)時(shí)指示，并可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝損傷。
腎臟
基于甲基化的檢測(cè)方法已越來(lái)越多地用于檢測(cè)腎臟損傷并了解與腎臟疾病相關(guān)的潛在分子機(jī)制。在腎臟患者中觀察到特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。在人類急性腎損傷的研究中，通過(guò)焦磷酸測(cè)序評(píng)估了健康對(duì)照組和急性腎損傷患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因啟動(dòng)子區(qū)四個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因啟動(dòng)子在全基因組模式中高于健康對(duì)照組（P<0.0001），表明KLK1基因甲基化有可能成為監(jiān)測(cè)腎損傷的標(biāo)志物。在另一項(xiàng)研究中，手術(shù)后第二天，通過(guò)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)到13名死者和10名活體腎移植受者以及65名健康對(duì)照者尿液DNA中兩個(gè)基因啟動(dòng)子（DAPK和CALCA）的異常甲基化，移植受者尿液中發(fā)現(xiàn)CALCA基因啟動(dòng)子異常甲基化的可能性明顯高于健康對(duì)照組（100%比31%；P<0.0001）。與活體供體移植相比，死亡患者尿液中鈣質(zhì)高甲基化增加（21.60） ± 12.5比12.19 ± 4.7條；P = 0.04）。此外，與急性排斥反應(yīng)和緩慢或快速移植功能相比，活檢證實(shí)的急性腎小管壞死患者的尿鈣異常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9、13.87±6.49、17.17±13.4；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7；P=0.5）。這些結(jié)果表明，尿DAPK和CALCA基因表觀遺傳學(xué)是一種有前途的急性缺血性損傷生物標(biāo)志物腎移植方法。在一項(xiàng)針對(duì)腎移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA，以了解感染與腎組織損傷之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，移植后組織特異性cfDNA尿液絕對(duì)濃度由于應(yīng)激損傷而增加，但在沒(méi)有感染的10天后恢復(fù)到基線。腎病合并BK病毒感染患者的腎源性cfDNA水平顯著高于正常人和單純BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）。此外，細(xì)菌感染患者的膀胱和白細(xì)胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染與組織損傷之間可能存在相關(guān)性。cfDNA片段大小譜可以提供一個(gè)指標(biāo)，通過(guò)該指標(biāo)可以對(duì)具有不同感染癥狀的患者進(jìn)行分層。這些發(fā)現(xiàn)表明，分析cfDNA水平可以提高我們對(duì)感染相關(guān)腎損傷的理解，并可能導(dǎo)致更好的診斷工具和治療方法。
心臟
基于cfDNA甲基化的檢測(cè)已被用于檢測(cè)各種情況下的心臟損傷，包括心臟直視手術(shù)和MI（心肌梗塞）。一項(xiàng)新的研究評(píng)估了cfDNA分子的六個(gè)非甲基化位點(diǎn)作為心臟直視手術(shù)后心臟損傷的標(biāo)志物。使用六種心肌細(xì)胞特異性DNA非甲基化標(biāo)記物檢測(cè)42名接受心臟直視手術(shù)的嬰兒血漿中的心臟cfDNA。手術(shù)后心臟cfDNA升高，反映了與手術(shù)直接相關(guān)的組織損傷，大多數(shù)患者術(shù)后cfDNA降低。本研究還使用心臟cfDNA水平來(lái)預(yù)測(cè)手術(shù)結(jié)果，選擇機(jī)械通氣持續(xù)時(shí)間（大于或小于24小時(shí)）和最大VIS（大于或小于20小時(shí)），并使用ROC（接受者操作特征）曲線作為臨床結(jié)果。作為機(jī)械通氣持續(xù)時(shí)間或最大VIS的預(yù)測(cè)指標(biāo)，術(shù)后6小時(shí)心臟cfDNA的AUC分別為0.7475和0.7555。類似地，在另一項(xiàng)研究中鑒定出心肌細(xì)胞甲基化標(biāo)記物（FAM101A）。ddPCR用于檢測(cè)完全未甲基化的FAM101A的血漿cfDNA濃度，其可以靈敏且特異性地檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷。膿毒癥患者的臨床觀察表明，心臟cfDNA水平不受腎臟或肝臟損傷的顯著影響。Jie Ren等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌損傷發(fā)生時(shí)，cfDNA被釋放并鑒定出位于CORO6、CACNA1C（兩個(gè)位點(diǎn)）、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六個(gè)CGCGCGG位點(diǎn)，顯示出心臟特異性高甲基化模式。在這些標(biāo)記物中，CORO6在心臟中顯示出最特異性甲基化模式。繼續(xù)研究針對(duì)該特定位點(diǎn)的ddPCR測(cè)定法的開(kāi)發(fā)，該測(cè)定法有效地檢測(cè)了MI患者入院時(shí)cfDNA中心臟損傷的信號(hào)。
肺
基于肺器官特異性cfDNA甲基化檢測(cè)已被用于檢測(cè)各種情況下的肺損傷，包括慢性阻塞性肺病、肺癌、肺結(jié)節(jié)和支氣管檢查后。在2022年的研究中鑒定了17個(gè)具有肺特異性甲基化模式位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，并將其用于評(píng)估健康志愿者和肺部疾病患者血漿中肺源性cfDNA。結(jié)果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化標(biāo)記允許對(duì)肺源性cfDNA進(jìn)行突變獨(dú)立、靈敏和特異性檢測(cè)，從而報(bào)告正在進(jìn)行的肺損傷。Wenhua Liang等人開(kāi)發(fā)了一種新的非侵入性診斷方法，該方法基于肺損傷釋放的cfDNA甲基化分析中的9種標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)早期肺癌并將肺癌與良性肺結(jié)節(jié)區(qū)分開(kāi)，該模型特異性達(dá)到93.2%。這九個(gè)標(biāo)記是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667、cg04175417、cg21962423、cg23156742、cg06287318、cg21963643、cg07568344和cg12545252。
腦
在2022年探索側(cè)支組織損傷的液體活檢研究中，還鑒定了10個(gè)基因組位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在神經(jīng)元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形膠質(zhì)細(xì)胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化。來(lái)自每種腦細(xì)胞類型的信號(hào)產(chǎn)生ROC曲線，每種腦細(xì)胞類型的標(biāo)志物都能夠識(shí)別腦轉(zhuǎn)移患者的血漿，AUC為0.72-0.81，神經(jīng)元標(biāo)志物的95%特異性、靈敏度為17.2%，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的95%特異性、靈敏度為13.8%。
胰腺
甲基化組織研究已經(jīng)能夠在器官中定位特定細(xì)胞類型，并且可以通過(guò)cfDNA甲基化分析檢測(cè)細(xì)胞損傷。例如，在血漿胰腺β細(xì)胞特異性cfDNA的研究中，發(fā)現(xiàn)70%的β細(xì)胞中有六種特異性生物標(biāo)志物（Fbxl19、Mtg1、Leng8、Zc3h3、INS、INS反義）完全未甲基化，其余30%表現(xiàn)出一個(gè)或兩個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化。該研究發(fā)現(xiàn)胰島移植后胰島β細(xì)胞中cfDNA甲基化標(biāo)志物顯著升高，反映了β細(xì)胞的損傷和死亡。此外，鑒于β細(xì)胞中未甲基化INS-CpG位點(diǎn)頻率增加，細(xì)胞死亡后釋放到循環(huán)中的未甲基化與甲基化INS-DNA比例反映了β細(xì)胞死亡。一項(xiàng)研究在編碼PRMT1染色質(zhì)靶標(biāo)（CHTOP）的基因內(nèi)鑒定了一個(gè)基因內(nèi)CpG位點(diǎn)，該位點(diǎn)對(duì)INS具有互補(bǔ)的組織特異性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年檢測(cè)胰島損傷的信心。兩種未甲基化生物標(biāo)志物組合的特異性高達(dá)100%。
肌肉
肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。目前，尚無(wú)確定的ALS循環(huán)生物標(biāo)志物。因此，很難監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展并有效評(píng)估治療反應(yīng)。cfDNA提供了一個(gè)檢測(cè)ALS細(xì)胞死亡的機(jī)會(huì)，填補(bǔ)這些空白。在一項(xiàng)研究中，從20名ALS患者和20名對(duì)照中分離出血漿cfDNA，與對(duì)照組相比，cfDNA用于鑒定ALS患者RHBDF2基因中的新型差異甲基化標(biāo)記。該研究進(jìn)行了ROC分析，以確定RHBDF2基因ALS的診斷效果。其中，RHBDF2基因具有兩個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC為0.724（CI 0.559-0.888；P=0.017），CpG2的AUC為0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）。區(qū)分ALS患者和對(duì)照組的最佳閾值為CpG1的65.97%（靈敏度=0.850，特異性=0.526）和CpG2的83.26%（靈敏度=0.800，特異性=0.474）。在現(xiàn)有研究中，針對(duì)甲基化cfDNA開(kāi)發(fā)了一種高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通過(guò)期望最大化進(jìn)行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS參考數(shù)據(jù)，允許低覆蓋率和噪聲數(shù)據(jù)。在該研究中，使用CelFiE從ALS患者和年齡匹配的對(duì)照中檢測(cè)到cfDNA。ALS和對(duì)照中cfDNA的總體豐度顯示出顯著差異。ALS組（n=28，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和對(duì)照組（n=25，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎縮側(cè)索硬化組（ALS組）骨骼肌比例估計(jì)值與對(duì)照組相比有顯著性差異（P=5.02×10-2）�？傊�，這些結(jié)果表明cfDNA是鑒定肌肉萎縮和死亡的第一個(gè)定量生物標(biāo)志物的有希望的方向，這是ALS的標(biāo)志。
總的來(lái)說(shuō)，人們對(duì)使用基于甲基化檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)器官和組織損傷的跡象越來(lái)越感興趣，并且在各種情況下發(fā)現(xiàn)了許多有希望的標(biāo)記物（圖3）。然而，需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證這些組織特異性甲基化標(biāo)記，并開(kāi)發(fā)有效的臨床診斷和預(yù)后工具。
圖3：在先前的研究中，已經(jīng)在組織和器官損傷中發(fā)現(xiàn)了cfDNA甲基化的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物10個(gè)與大腦有關(guān)，9個(gè)與肺有關(guān)，6個(gè)與心臟有關(guān)，7個(gè)與肝臟有關(guān)，3個(gè)與腎臟有關(guān)，7個(gè)與胰腺有關(guān)，1個(gè)與肌肉有關(guān)
從組織器官損傷特異性cfDNA甲基化標(biāo)志物鑒定到臨床檢測(cè)路徑
基于甲基化的損傷檢測(cè)依賴于組織和器官損傷后DNA甲基化模式變化。甲基化模式對(duì)于每種細(xì)胞類型都是特異性的，在同一個(gè)體內(nèi)部和同一細(xì)胞類型中保守，并且在生理或病理?xiàng)l件下高度穩(wěn)定。因此有可能利用與組織和器官損傷相關(guān)的特定cfDNA甲基化模式來(lái)鑒定起源組織并推斷組織和器官損傷的程度。鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記及其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用需要多步驟方法。然而，鑒于新生物標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)和提出，建立一個(gè)強(qiáng)大的生物標(biāo)志物驗(yàn)證和認(rèn)證系統(tǒng)以確保廣泛接受和正確使用成為當(dāng)務(wù)之急。遵循生物標(biāo)志物認(rèn)證的各種原則，推斷鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)志物并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)過(guò)程可能需要幾個(gè)不同的階段，如圖4所示。值得注意的是，利用甲基化分析進(jìn)行組織損傷檢測(cè)仍處于早期研究階段。到目前為止，還沒(méi)有進(jìn)行臨床研究，也沒(méi)有將商業(yè)產(chǎn)品引入臨床環(huán)境。
圖4：cfDNA甲基化檢測(cè)組織器官損傷的發(fā)展路徑。該路徑概述了將潛在標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為診斷和監(jiān)測(cè)組織和器官損傷的臨床有用工具所必需的研究和開(kāi)發(fā)進(jìn)展
鑒定和驗(yàn)證潛在的甲基化標(biāo)記
美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對(duì)生物標(biāo)志物的使用設(shè)定了四個(gè)類別：預(yù)后性、預(yù)測(cè)性、反應(yīng)指示性和療效反應(yīng)性（表2）。首先，通過(guò)進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，并確定與組織和器官損傷相關(guān)的潛在甲基化標(biāo)志物。這可以通過(guò)響應(yīng)損傷的甲基化變化的研究或者已經(jīng)鑒定與健康組織相比患病組織中的DMR（差異甲基化區(qū)域）的研究來(lái)完成。例如在肝損傷生物標(biāo)志物的研究中，通過(guò)檢查WGBS數(shù)據(jù)并鑒定差異甲基化或差異非甲基化區(qū)域來(lái)選擇肝細(xì)胞特異性CpG位點(diǎn)。為了選擇高甲基化標(biāo)記，確定了肝細(xì)胞樣品的75th百分位數(shù)和所有非肝細(xì)胞樣本的5th百分位數(shù)之間差異超過(guò)0.5的區(qū)域。對(duì)于低甲基化標(biāo)記物，需要在95th和20th百分位數(shù)之間有0.5的差異。通過(guò)這種方式，總共篩選出三種肝細(xì)胞標(biāo)志物（cg02396797、cg030646442、cg21178851）。甲基化DNA數(shù)據(jù)庫(kù)是研究與組織損傷相關(guān)的DNA甲基化模式的寶貴資源。這些數(shù)據(jù)庫(kù)可用于鑒定生物標(biāo)志物、理解分子機(jī)制、評(píng)估嚴(yán)重程度、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)以及研究環(huán)境和生活方式因素。數(shù)據(jù)庫(kù)包括參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)、癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（表3）。這些數(shù)據(jù)庫(kù)為有興趣鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的甲基化標(biāo)記的研究人員提供了寶貴的資源。
表2：FDA生物標(biāo)志物分類
表3：常見(jiàn)DNA甲基化數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容和網(wǎng)站
建立檢測(cè)分析
一旦確定了潛在的甲基化標(biāo)記，就需要開(kāi)發(fā)一種甲基化檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)這些標(biāo)記中的甲基化變化。根據(jù)所分析的特定標(biāo)記，檢測(cè)方法可以基于不同的技術(shù)，例如MSP（甲基化特異性PCR）、焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）、WGBS（全基因組甲基化測(cè)序）或DNA甲基化芯片。設(shè)計(jì)分析方法后，需要優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)，包括優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、退火溫度（annealing temperature）、循環(huán)條件和檢測(cè)方法等檢測(cè)參數(shù)，以確保準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)已鑒定標(biāo)記中的甲基化變化。
例如Miguel Waterhouse開(kāi)發(fā)了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化測(cè)定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的組織損傷。同樣Tulsi K.Mehta等人設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增CALCA基因的引物和探針，以開(kāi)發(fā)一種qPCR（定量PCR）檢測(cè)方法，該方法有望用于評(píng)估移植環(huán)境中的急性腎損傷。在人類急性腎損傷的研究中，通過(guò)焦磷酸測(cè)序評(píng)估了KLK1基因的四個(gè)連續(xù)CpG甲基化，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-203bp至-135bp之間。在cfDNA甲基化研究中，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序來(lái)檢測(cè)cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化狀態(tài)，其中甲基化敏感的TaqMan探針用于分析亞硫酸氫鹽處理的cfDNA。探針的有限長(zhǎng)度（最多30 bp）決定了它們只能覆蓋2-4個(gè)提供信息的CpG位點(diǎn)。IGF2R位點(diǎn)覆蓋了四個(gè)CpG。VTN位點(diǎn)的探針中只覆蓋兩個(gè)CpGs ，預(yù)測(cè)非肝組織DNA中相對(duì)較高的噪聲頻率（陽(yáng)性液滴）。設(shè)計(jì)了兩個(gè)TaqMan探針以提高特異性，每個(gè)探針都從VTN位點(diǎn)相同擴(kuò)增的100 bp片段中鑒定出不同嘧啶簇（每個(gè)簇包含兩個(gè)CpG位點(diǎn)）中的甲基化缺失，并且每個(gè)探針都用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記。
分析有效性
分析有效性是驗(yàn)證檢測(cè)方法的一個(gè)重要方面，該檢測(cè)方法評(píng)估所開(kāi)發(fā)測(cè)定的準(zhǔn)確性和可靠性，包括精確度、靈敏度和特異性。為了確保所開(kāi)發(fā)的甲基化檢測(cè)方法的分析有效性，應(yīng)采取以下步驟：
精確度評(píng)估：使用已知甲基化狀態(tài)的對(duì)照樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的精確度。通過(guò)分析重復(fù)樣品來(lái)計(jì)算內(nèi)部精確度和外部精確度，以確定方法的精確度。
靈敏度評(píng)估：使用已知甲基化水平較低或甲基化變化較小的樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的靈敏度。評(píng)估該方法準(zhǔn)確檢測(cè)微小甲基化變化的能力。
特異性評(píng)估：使用具有不同甲基化模式或來(lái)自不同來(lái)源的樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的特異性。確定該方法準(zhǔn)確檢測(cè)甲基化變化而無(wú)假陽(yáng)性的能力。
使用具有已知甲基化狀態(tài)的對(duì)照樣品驗(yàn)證開(kāi)發(fā)的測(cè)定法有助于建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。這有助于評(píng)估該方法在甲基化檢測(cè)中的性能，并為其臨床應(yīng)用提供可靠的基礎(chǔ)。
臨床有效性
在建立分析有效性后，會(huì)啟動(dòng)臨床研究以建立臨床有效性：證明生物標(biāo)志物和檢測(cè)方法適合特定使用背景的目的，即分析結(jié)果將為醫(yī)療決策提供信息。應(yīng)使用臨床樣品評(píng)估所開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法的臨床有效性，例如從具有特定組織或器官損傷的患者獲得的血液或組織樣品。該驗(yàn)證過(guò)程旨在確定該測(cè)定是否可以有效區(qū)分有損傷和無(wú)損傷患者，并評(píng)估損傷個(gè)體的臨床靈敏度、臨床特異性和檢出率。臨床靈敏度是指測(cè)定正確鑒定具有特定組織或器官損傷的個(gè)體的能力，而臨床特異性是指測(cè)定正確識(shí)別沒(méi)有損傷的個(gè)體的能力。應(yīng)評(píng)估該測(cè)定的靈敏度和特異性，以確定其在臨床環(huán)境中的準(zhǔn)確性。此外，應(yīng)評(píng)估受傷個(gè)體的檢出率，這反映了臨床診斷為受傷的患者中陽(yáng)性結(jié)果的比例。這些信息可以幫助評(píng)估檢測(cè)方法在檢測(cè)預(yù)期患者群體中特定組織或器官損傷方面的性能。
例如，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化檢測(cè)方法在28名急性移植物抗宿主�。╝GvHD）患者和11名無(wú)相關(guān)癥狀的患者中進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，區(qū)分肝臟aGvHD與非aGvHD的最佳閾值為1.5（logPTK2拷貝/mL血漿；靈敏度：0.928；特異性：0.910）。同樣，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供體、85名局部癌癥（非肝臟）患者、55名非肝臟轉(zhuǎn)移性癌癥患者和63名有肝臟轉(zhuǎn)移的癌癥患者，以驗(yàn)證基于cfDNA PCR測(cè)序分析的檢測(cè)方法在區(qū)分肝臟轉(zhuǎn)移方面的表現(xiàn)。結(jié)果表明，通過(guò)這種方法檢測(cè)到的肝細(xì)胞的AUC濃度為0.81（95%置信區(qū)間=0.74–0.87，P= 0.0001）。肝臟轉(zhuǎn)移檢測(cè)的特異性和靈敏度分別為95%和35%。
臨床效用
臨床效用是指在考慮PPV（陽(yáng)性預(yù)測(cè)值）、NVP（陰性預(yù)測(cè)值）和成本等因素下，評(píng)估患者檢測(cè)中開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法的成本效益。臨床效用的評(píng)估可以考慮多種因素，包括但不限于以下因素。
診斷準(zhǔn)確性：評(píng)估甲基化檢測(cè)方法在正確鑒定患者組織或器官損傷方面的靈敏度、特異性、PPV和NPV。臨床影響：評(píng)估甲基化檢測(cè)方法對(duì)治療決策和患者管理的影響，例如它是否有助于選擇適當(dāng)?shù)闹委熯x項(xiàng)、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)或預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)。
成本效益：考慮與甲基化檢測(cè)過(guò)程相關(guān)的成本，包括樣本收集、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋，并將其與潛在的益處進(jìn)行權(quán)衡，如改善患者結(jié)果、降低醫(yī)療保健成本和提高患者滿意度。
可行性和可擴(kuò)展性：評(píng)估在臨床環(huán)境中實(shí)施甲基化檢測(cè)方法的實(shí)際可行性，包括樣本收集的便利性、所需的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)知識(shí)，以及擴(kuò)展到更大患者人群的可擴(kuò)展性。
比較效果：在準(zhǔn)確性、臨床影響和成本效益方面，將甲基化檢測(cè)方法與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法或替代方法進(jìn)行比較。
倫理和法律考慮：在評(píng)估臨床效用時(shí)，考慮倫理和法律考慮因素，如患者隱私、知情同意和遵守監(jiān)管要求。
總之，鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記物，并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)，需要一種嚴(yán)格和系統(tǒng)的方法，涉及多個(gè)研究、驗(yàn)證和檢測(cè)階段。然而，值得注意的是，目前使用甲基化分析進(jìn)行組織損傷檢測(cè)仍處于研究的早期階段，迄今為止，尚未進(jìn)行臨床研究，也未在臨床環(huán)境中實(shí)施任何商業(yè)產(chǎn)品。
研究人員、臨床醫(yī)生和行業(yè)伙伴之間的合作對(duì)于確�；诩谆脑\斷檢測(cè)方法的成功開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用非常必要。
挑戰(zhàn)和未來(lái)方向
結(jié)合之前的討論，研究甲基化標(biāo)記物在組織和器官損傷中的應(yīng)用存在一些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)和未來(lái)的研究方向包括：
個(gè)體之間甲基化模式的變異性
根據(jù)之前的大量研究，DNA甲基化模式在個(gè)體之間差異很大，并且與性別、生活環(huán)境和許多其他因素有關(guān)。因此，在臨床上使用DNA甲基化分析來(lái)檢測(cè)組織損傷仍然存在許多困難。這一挑戰(zhàn)的一個(gè)潛在解決方案是使用大規(guī)模研究來(lái)確定跨人群一致的甲基化模式，而不是依賴于單個(gè)標(biāo)記。這種方法可以幫助鑒定不同個(gè)體之間常見(jiàn)的甲基化模式，并且可以用作鑒定與不同組織或器官相關(guān)的甲基化變化的參考。通過(guò)鑒定這些常見(jiàn)模式，研究人員可以減少個(gè)體變異性的影響，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性。另一種方法包括利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)辨別特定類型組織損傷所特有的甲基化模式。這種方法不再僅僅依賴于可能受個(gè)體變異性影響的個(gè)體標(biāo)記，而是側(cè)重于能夠提供更穩(wěn)健和可靠見(jiàn)解的綜合模式。這種方法可以幫助鑒定與特定類型的組織損傷或疾病相關(guān)的甲基化變化。通過(guò)關(guān)注特定的甲基化模式，研究人員可以減少個(gè)體變異性的影響，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性。
外部因素對(duì)甲基化模式的影響
由于外部因素對(duì)DNA甲基化模式的影響，這種影響可能會(huì)干擾組織和器官損傷篩查，診斷和治療的決策。未來(lái)的研究可以集中在鑒定和調(diào)控可能影響甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和環(huán)境暴露。可以通過(guò)收集有關(guān)這些因素的詳細(xì)信息的大規(guī)模人群研究以及使用動(dòng)物模型研究特定暴露對(duì)甲基化模式影響的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)完成。例如，當(dāng)Kang Li研究HBV與相關(guān)慢性肝炎之間的關(guān)系以及外周免疫系統(tǒng)的甲基化時(shí)，發(fā)現(xiàn)外周免疫系統(tǒng)的甲基化模式受到外部因素的影響。因此，他們將Bonferroni校正應(yīng)用于代償性肝硬化預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中的潛在混雜因素，并發(fā)現(xiàn)了真正顯著的相關(guān)性。
檢測(cè)方法的技術(shù)局限性和不一致性
現(xiàn)有的甲基化檢測(cè)方法也存在技術(shù)缺陷，例如靈敏度和特異性問(wèn)題。該領(lǐng)域的研究可以集中于開(kāi)發(fā)更靈敏和更具體的檢測(cè)甲基化變化的方法。這可能包括使用納米孔測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序等新技術(shù)，以及開(kāi)發(fā)用于分析甲基化數(shù)據(jù)的改進(jìn)生物信息學(xué)工具。此外，研究可以集中于鑒定和解決現(xiàn)有甲基化檢測(cè)方法的技術(shù)局限性。例如，亞硫酸鹽測(cè)序是檢測(cè)DNA甲基化最常用的方法，由于亞硫酸鹽處理過(guò)程中未甲基化C和DNA損傷的不完全轉(zhuǎn)化，可能會(huì)產(chǎn)生偏差和不準(zhǔn)確。解決這些問(wèn)題的新方法，例如使用替代化學(xué)處理或改進(jìn)的酶轉(zhuǎn)化方法，可以提高甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，研究可以調(diào)查技術(shù)因素對(duì)甲基化分析的影響，例如DNA質(zhì)量和數(shù)量，測(cè)序深度和文庫(kù)制備方法。鑒定和減輕這些因素可以幫助減少變異并提高甲基化研究的可重復(fù)性。
結(jié)論與展望
甲基化檢測(cè)方法在各種情況下表現(xiàn)出檢測(cè)器官和組織損傷方面的巨大潛力。這些檢測(cè)有望檢測(cè)早期損傷、監(jiān)測(cè)組織和器官損傷的進(jìn)展，評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)移植結(jié)果。然而，仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，包括甲基化模式的變異性，可能影響甲基化模式的外部因素以及檢測(cè)方法的技術(shù)局限性。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但人們對(duì)這一領(lǐng)域產(chǎn)生了濃厚的興趣，正在進(jìn)行的研究繼續(xù)確定有前途的標(biāo)記物，并開(kāi)發(fā)有效的診斷和監(jiān)測(cè)工具。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的檢測(cè)有可能通過(guò)分析血液或其他體液來(lái)顯著改善臨床環(huán)境中器官和組織損傷的診斷和管理，這將顯著改善患者獲得診斷測(cè)試和監(jiān)測(cè)。使用基于DNA甲基化的檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)不同治療的反應(yīng)，可以為器官和組織損傷提供個(gè)性化醫(yī)療方法。研究表觀遺傳變化（包括DNA甲基化）在器官和組織損傷的發(fā)展和進(jìn)展中的作用，也將為疾病機(jī)制和潛在的新治療靶點(diǎn)提供見(jiàn)解。
參考文獻(xiàn)：Zhang L, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detection of tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168. pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID: 37858233.
Introduction
檢測(cè)器官和組織損傷對(duì)于及時(shí)診斷和有效治療各種疾病和病癥至關(guān)重要。早期發(fā)現(xiàn)組織損傷可以及時(shí)干預(yù)，防止進(jìn)一步的損傷并可能改善預(yù)后。監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展也可以幫助告知治療決策，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。此外，評(píng)估治療效果可以幫助確定干預(yù)措施是否有效，并為繼續(xù)或修改治療計(jì)劃的決定提供信息。最后，在移植醫(yī)學(xué)中，檢測(cè)組織損傷對(duì)于評(píng)估移植器官的生存能力和確保受體成功結(jié)果至關(guān)重要。在此前研究中，組織切片的組織病理學(xué)檢查通常被認(rèn)為是檢測(cè)組織和器官損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，這種方法是高度侵入性的，不適用于組織和器官損傷的早期篩查。
CpG位點(diǎn)是DNA上的特定區(qū)域，以C（胞嘧啶）和鳥嘌呤核苷酸命名，通過(guò)磷酸二酯鍵連接。這些位點(diǎn)廣泛分布于整個(gè)人類基因組中，對(duì)基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。在許多研究中，CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。DNA甲基化也因組織損傷而變化�；诩谆臋z測(cè)為檢測(cè)器官和組織損傷提供了一種有前途的方法。基于DNA甲基化模式的表觀遺傳分析包括DNA甲基化模式的研究，以檢測(cè)可能反映組織損傷或疾病相關(guān)變化的跡象。這些測(cè)試方法具有高度的特異性和靈敏度，可應(yīng)用于各種樣本類型，包括血液、尿液和組織活檢，促進(jìn)非侵入性數(shù)據(jù)收集，并大大推進(jìn)組織損傷的早期診斷�；诩谆臋z測(cè)方法正在研究一系列應(yīng)用，從早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展到評(píng)估治療效果和評(píng)估移植器官活力。
液體活檢，特別是血漿中循環(huán)cfDNA甲基化分析，可能成為組織損傷檢測(cè)中一種有前途的非侵入性診斷方法。血液或體液樣本的收集是一種非侵入性程序，不需要組織切除或組織活檢，從而避免了傳統(tǒng)組織檢查的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)。大多數(shù)cfDNA片段的范圍為80-200 bp，長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)于核小體大小160-180 bp。起源組織解卷積是cfDNA甲基化分析中的關(guān)鍵技術(shù)，使研究人員能夠根據(jù)DNA甲基化模式確定cfDNA來(lái)源。該技術(shù)基于一個(gè)核心概念：不同的組織和器官在其DNA甲基化譜中具有獨(dú)特的表觀遺傳特征。因此，當(dāng)這些組織或器官受損時(shí)，例如由于癌癥、創(chuàng)傷或其他導(dǎo)致細(xì)胞死亡的疾病，它們會(huì)將cfDNA釋放到血液中（圖1A）。研究人員可以分析這些cfDNA樣本中的DNA甲基化模式，并嘗試將其與已知組織特異性DNA甲基化模式的參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。通過(guò)這種比較，他們可以解卷積或確定給定cfDNA樣品來(lái)源組織或器官。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠以非侵入性方式檢測(cè)和監(jiān)測(cè)組織特異性損傷，而不需要傳統(tǒng)的組織活檢。
圖1：cfDNA的來(lái)源。
- cfDNA向體液中的釋放來(lái)源于組織和器官，包括血液、腦脊液和尿液等。
- 受損的組織和器官將甲基化模式改變的cfDNA釋放到血液中，可以檢測(cè)到
如圖1B所示，組織和器官損傷后cfDNA形式的表觀遺傳標(biāo)記物釋放到血流中，使cfDNA成為評(píng)估組織和器官損傷的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)，包括DNA高甲基化和低甲基化模式，可以提供對(duì)組織和器官損傷程度的見(jiàn)解�？傮w而言，cfDNA的DNA甲基化狀態(tài)可用作組織和器官損傷的生物標(biāo)志物。本文將研究cfDNA甲基化涉及的潛在機(jī)制，用于檢測(cè)器官和組織損傷的cfDNA甲基化模式的當(dāng)前研究現(xiàn)狀，以及這些檢測(cè)在臨床實(shí)踐中的潛在應(yīng)用。
表觀遺傳學(xué)和DNA甲基化
即使DNA序列保持不變，真核基因表達(dá)也通過(guò)多種機(jī)制受復(fù)雜調(diào)控，這種現(xiàn)象被稱為表觀遺傳學(xué)。表觀遺傳調(diào)控涉及多種機(jī)制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。其中DNA甲基化研究非常廣泛。
在真核生物中，DNA甲基化涉及在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，在DNA中C的第5個(gè)碳上添加一個(gè)甲基，產(chǎn)生了5-mC（5-甲基胞嘧啶），主要位于CpG位點(diǎn)。人類基因組中約有2.8M的CpG位點(diǎn)，但其分布并不均勻。CpG序列平均僅發(fā)生約1%，CGI（CpG島）是密集的區(qū)域，其頻率是平均頻率的五倍以上，通常定義為超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的基因組區(qū)域，GC含量超過(guò)50%，CpG比率超過(guò)60%。超過(guò)60%的基因，包括具有組織特異性表達(dá)模式的基因，在其啟動(dòng)子區(qū)域和第一外顯子中具有CpG島。
在正常組織基因組中，約70%的CpG位點(diǎn)被甲基化，而大多數(shù)CpG島未甲基化。一些CGI基因被甲基化，如非活性X染色體上的基因和印跡基因。甲基化在各種生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、X染色體失活、基因組印跡、基因沉默、防御外源基因以及多細(xì)胞生物中的異生素代謝。
表觀遺傳機(jī)制的研究在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)中具有巨大意義，增強(qiáng)了對(duì)基因調(diào)控、疾病發(fā)生和遺傳以及創(chuàng)新療法發(fā)展的理解。
DNA甲基化在器官和組織損傷中的變化機(jī)制
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是一類在細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的酶，可以調(diào)控DNA甲基化。DNMT主要負(fù)責(zé)向DNA中的胞嘧啶殘基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)DNA甲基化。DNMT能夠與DNA結(jié)合并識(shí)別靶DNA序列，通常是CpG。一旦DNMT與靶DNA序列結(jié)合，它們就會(huì)將甲基從SAM供體轉(zhuǎn)移到DNA中的胞嘧啶堿基。該過(guò)程涉及形成共價(jià)鍵，將甲基添加到胞嘧啶堿基的第五個(gè)碳原子上，產(chǎn)生5-mC。DNMT1（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1）作為維持DNMT，主要任務(wù)是在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂過(guò)程中維持DNA甲基化穩(wěn)定性。DNMT1可以識(shí)別新合成的未甲基化DNA鏈，并在DNA復(fù)制過(guò)程中添加甲基，以確保每一代細(xì)胞中DNA甲基化模式的正確遺傳。
DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，負(fù)責(zé)在細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中引入新的DNA甲基化。這些酶可以將甲基引入特定基因或基因組區(qū)域，從而調(diào)控基因表達(dá)并影響細(xì)胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵組成部分。TET酶可以從DNA中去除甲基，將5-mC轉(zhuǎn)化為5hmC（5-羥甲基胞嘧啶），并參與DNA去甲基化過(guò)程。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶）和AB（Apobec）是脫氨酶，通常與DNA堿基脫氨和脫氧核糖修飾有關(guān)，而不是直接參與DNA甲基化或去甲基化反應(yīng)。它們?cè)诟淖僁NA堿基方面起作用，例如將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而不涉及DNA甲基的添加或去除。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是與DNA修復(fù)相關(guān)的兩種酶，在維持DNA堿基的完整性和糾正DNA堿基錯(cuò)誤方面起著至關(guān)重要的作用。這些酶向DNA分子引入脫氨或脫氧核糖基化等變化，影響DNA甲基化狀態(tài)。組織和器官損傷可以通過(guò)各種機(jī)制調(diào)控DNMT和DNA去甲基化酶，從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機(jī)制。這些機(jī)制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的復(fù)雜變化，并導(dǎo)致?lián)p傷和疾病的持續(xù)（圖2）。
圖2：器官和組織損傷中的DNA甲基化和去甲基化機(jī)制。組織和器官損傷可以通過(guò)各種機(jī)制調(diào)控DNMT和DNA去甲基化酶（如TET和TDG），從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷修復(fù)機(jī)制
炎癥
在組織和器官損傷后，身體啟動(dòng)炎癥反應(yīng)以清除受損的細(xì)胞和組織，促進(jìn)修復(fù)和再生。然而，這種炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致DNA甲基化變化，因?yàn)檠装Y反應(yīng)可以產(chǎn)生活性氧（ROS），亞硝酸鹽和其他可能直接或間接影響DNA甲基化的有害物質(zhì)。炎癥還可以激活免疫細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子和其他信號(hào)分子的分泌，從而改變DNA甲基化模式。例如，IL-6（細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6）和STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）已被證明可增加DNMT活性，從而導(dǎo)致某些基因的DNA甲基化增加。過(guò)量的IL-15（細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-15）在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)DNMT3b（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3b）上調(diào)和整體DNA高甲基化。
氧化應(yīng)激
由于受損細(xì)胞釋放的自由基、過(guò)氧化物和其他氧化劑，組織和器官損傷可能會(huì)增加細(xì)胞氧化應(yīng)激，可能會(huì)破壞DNA并改變調(diào)控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致DNMT氧化，導(dǎo)致活性改變和DNA甲基化模式改變。在最近對(duì)Graves病患者外周血單核細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)活性氧增加導(dǎo)致DNMT1表達(dá)增加，反過(guò)來(lái)又與促進(jìn)Graves病自身免疫的免疫調(diào)控基因異常甲基化模式有關(guān)。類似地，在多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性的研究中，多柔比星誘導(dǎo)心臟細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生自由基和一氧化氮以響應(yīng)應(yīng)激。氧化應(yīng)激增加并下調(diào)DNMT1酶活性，導(dǎo)致DNA甲基化的線粒體功能障礙。氧化應(yīng)激還可以改變從DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，從而導(dǎo)致DNA甲基化模式變化。在多囊卵巢綜合征疾病研究中構(gòu)建的細(xì)胞損傷模型中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷降低了TET水平并導(dǎo)致細(xì)胞甲基化水平升高。
DNA損傷修復(fù)
DNA損傷是組織和器官損傷的常見(jiàn)后果，DNA修復(fù)機(jī)制被激活以修復(fù)損傷。DNA修復(fù)過(guò)程可以影響DNA甲基化模式，因?yàn)橐恍〥NA修復(fù)酶可以改變DNA甲基化水平。例如，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一種參與DNA修復(fù)、染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)的核酶（nuclear enzyme），可以催化甲基全基因組染色質(zhì)去除。PARP1與染色質(zhì)全基因組的結(jié)合與DNA甲基化模式互斥，表明PARP1與DNA甲基化之間存在功能互作。事實(shí)上，抑制PARylation會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化模式的全基因組變化。DNA雙加氧酶AlkB也可以調(diào)控DNA甲基化水平，AlkB可以通過(guò)在Fe（II）離子，α-KG和氧氣存在下的氧化去甲基化機(jī)制將m3C和m1A直接轉(zhuǎn)化為未甲基化堿基。在一項(xiàng)血液疾病研究中，生發(fā)中心的B細(xì)胞在DNMT1幫助下分化，改變其DNA模式以正確分化。DNMT1在DNA甲基化和雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮雙重作用。
總之，組織和器官損傷可以通過(guò)多種機(jī)制引起DNA甲基化模式變化，這些機(jī)制可以互作以產(chǎn)生DNA甲基化模式的復(fù)雜變化。
5-mC甲基化檢測(cè)技術(shù)
研究人員利用各種DNA甲基化檢測(cè)方法研究cfDNA中的甲基化，從而了解健康和疾病狀態(tài)下的甲基化變化。這些方法主要包括一系列5-mC甲基化檢測(cè)，可分為以下幾類：
非測(cè)序的甲基化檢測(cè)方法
非測(cè)序甲基化檢測(cè)方法通常不涉及DNA測(cè)序，而是依賴各種化學(xué)或生物技術(shù)來(lái)分析DNA甲基化狀態(tài)。這些方法包括限制性酶消化，包括使用甲基化敏感酶在特定核苷酸序列切割DNA，從而可以研究DNA甲基化。例如，von Kanel等人結(jié)合限制性內(nèi)切酶消化和實(shí)時(shí)PCR或Xianfeng Wang等人基于CRISPR/Cas13a的策略等方法能夠精確評(píng)估單個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)和拷貝數(shù)變化。此外，MSP（甲基化特異性PCR）和其他使用亞硫酸鹽處理的DNA模板的基于PCR的方法是分析特定位點(diǎn)DNA甲基化的靈敏和特異性技術(shù)，MSP使用甲基化特異性引物選擇性擴(kuò)增甲基化或未甲基化的DNA序列。這些方法，包括TaqMan實(shí)時(shí)FQ-MSP（TaqMan實(shí)時(shí)甲基化特異性PCR）和ddPCR（數(shù)字液滴PCR），提供了高精度和靈敏度，使其成為研究DNA甲基化的有價(jià)值的工具。例如，MSP聯(lián)合ddPCR已被用于檢測(cè)原發(fā)性硬化性膽管炎患者的膽管癌標(biāo)志物。此外，HRM（高分辨率熔解）是一種基于甲基化和非甲基化DNA片段的不同熔解行為檢測(cè)DNA甲基化的方法。HRM允許對(duì)DNA甲基化進(jìn)行定性和定量分析，而不需要昂貴的測(cè)序技術(shù)，從而提供了一種廣泛用于DNA甲基化研究的快速，高通量和經(jīng)濟(jì)高效的方法。Wojdacz和Dobrovic的MS-HRM（甲基化靈敏的高分辨率熔解）方案可以檢測(cè)未甲基化中的甲基化panel，其靈敏度與MSP相當(dāng)。Lasse Kristensen等人還開(kāi)發(fā)了一種無(wú)探針定量MSP分析方法，使用HRM分析進(jìn)行可靠檢測(cè)，即使在0.1%甲基化標(biāo)準(zhǔn)下也是如此。此外，甲基化芯片如Illumina的HM450K（Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip）和850K（Illumina Infinium methylation EPIC Bead Chip）為全面的甲基化分析提供了具有成本效益和高通量的平臺(tái)，HM450K靶向人類基因組中超過(guò)485000個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)，并被廣泛用于癌癥研究。較新的850K芯片擴(kuò)展了覆蓋范圍，包括針對(duì)調(diào)控區(qū)的其他探針，但這些陣列的全基因組覆蓋范圍有限，可能無(wú)法捕獲所有甲基化信息�，F(xiàn)已更新至935k芯片。
測(cè)序的甲基化檢測(cè)方法
基于測(cè)序的DNA甲基化檢測(cè)方法包括一系列用于研究DNA甲基化模式的技術(shù)。一種廣泛使用的方法是BSP（亞硫酸鹽測(cè)序PCR），它將PCR擴(kuò)增與Sanger測(cè)序相結(jié)合，以鑒定單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化位點(diǎn)。BSP有兩種形式：直接BSP，它直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，克隆BSP，它涉及將PCR產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序。然而BSP具有局限性，例如對(duì)低水平鑲嵌的靈敏度和潛在的PCR誘導(dǎo)的偏倚。
焦磷酸測(cè)序通過(guò)定量檢測(cè)核苷酸的摻入來(lái)實(shí)時(shí)高分辨率和靈敏地監(jiān)測(cè)DNA甲基化，這對(duì)于各種研究和臨床應(yīng)用都很有價(jià)值，包括癌癥預(yù)測(cè)和重復(fù)元素研究。
WGBS（全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序）提供了全面和高分辨率的全基因組甲基化信息，是甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它面臨著復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理和高測(cè)序要求等挑戰(zhàn)。另一方面，MCTA-seq（甲基化CpG串聯(lián)擴(kuò)增和測(cè)序）是一種靈敏的方法，能夠分析微小的基因組DNA量（低至7.5 pg），有望用于非侵襲性癌癥篩查。然而，與全基因組方法相比，它可能需要專門的設(shè)備，且覆蓋范圍有限。
靶向亞硫酸鹽測(cè)序（Target-seq）選擇性地?cái)U(kuò)增特定的基因組區(qū)域，將甲基化陣列的成本效益與亞硫酸鹽測(cè)序的數(shù)字信號(hào)相結(jié)合。可以針對(duì)特定的基因或區(qū)域進(jìn)行定制，但可能需要額外的時(shí)間和資源來(lái)進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和合成。
RRBS（減少代表性亞硫酸鹽測(cè)序）是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，專注于CpG富集區(qū)域，并實(shí)現(xiàn)了scRRBS（單細(xì)胞RRBS）等進(jìn)步，為腫瘤負(fù)荷估計(jì)和疾病生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)提供了見(jiàn)識(shí)。
MeDIP-Seq（甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序）減少了甲基化測(cè)序所需的DNA input，使其適用于cfDNA甲基化檢測(cè)。該方法的擴(kuò)展cfMeDIP-seq（cfDNA甲基化DNA免疫沉淀和高通量測(cè)序）可應(yīng)用于DNA可用性有限的各種樣品類型，可能將其應(yīng)用擴(kuò)展到癌癥檢測(cè)之外。
MBD-Seq（CpG甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域富集測(cè)序）使用MBD（甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域）蛋白選擇性捕獲甲基化DNA片段，有效鑒定和定量甲基化區(qū)域，特別是CpG和CGI富集區(qū)域。超低 input cfDNA甲基化分析方法cfMBD-seq（cfDNA-MBD-seq）優(yōu)化了用于各種樣品類型的MBD捕獲條件。
納米孔測(cè)序是一種革命性的技術(shù)，可直接檢測(cè)DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)的電流變化，從而實(shí)現(xiàn)直接甲基化檢測(cè)，而無(wú)需化學(xué)修飾。例如ONT（牛津納米孔技術(shù)）具有高通量、高分辨率和單分子測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，在包括癌癥檢測(cè)在內(nèi)的各種研究和臨床應(yīng)用中具有重要價(jià)值。然而它有局限性，包括單核苷酸變異和插入/缺失的每堿基成本和錯(cuò)誤率較高。
基于SMRT（單分子實(shí)時(shí)）技術(shù)的PacBio測(cè)序產(chǎn)生異常長(zhǎng)的DNA讀長(zhǎng)，使其適用于研究復(fù)雜的基因組，結(jié)構(gòu)變異，重復(fù)序列和重復(fù)元件的表觀遺傳變化。可以在沒(méi)有GC或AT含量偏好的情況下分析不同的基因組和DNA樣品。
cfDNA甲基化檢測(cè)特異性組織及器官損傷的研究現(xiàn)狀
基于cfDNA甲基化的檢測(cè)在檢測(cè)組織和器官損傷方面具有巨大潛力，該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究可以為各種組織和器官疾病提供新的診斷和預(yù)后工具。以下描述了cfDNA甲基化在檢測(cè)特定器官組織和器官損傷中的研究現(xiàn)狀（表1）。
表1：特定組織和器官損傷的cfDNA甲基化標(biāo)記
肝臟
基于肝源性cfDNA甲基化檢測(cè)方法已被用于檢測(cè)各種情況下的肝損傷，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝、肝細(xì)胞癌和肝移植。Miguel Waterhouse等人使用數(shù)字液滴PCR檢測(cè)cfDNA中PTK28基因特異性甲基化標(biāo)記，以檢測(cè)急性移植物抗宿主病患者的肝組織損傷。區(qū)分肝臟中aGvHD（急性移植物抗宿主病）和非aGvHD（非急性移植物抗宿主�。┑拈撝禐�1.5（靈敏度=0.928；特異性=0.910），肝損傷aGvHD的臨床改善導(dǎo)致甲基化PTK2B濃度降低。在另一項(xiàng)關(guān)于癌癥對(duì)宿主組織損害的研究中，發(fā)現(xiàn)受癌癥影響的器官中細(xì)胞死亡可以通過(guò)cfDNA組織特異性甲基化模式來(lái)檢測(cè)。在肝細(xì)胞癌研究中，通過(guò)Illumina Infinium 450k芯片鑒定了三種肝組織甲基化特異性標(biāo)志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。與健康供體、局部癌癥患者或非肝轉(zhuǎn)移性疾病患者相比，肝轉(zhuǎn)移患者表現(xiàn)出更高水平的肝細(xì)胞來(lái)源cfDNA，無(wú)論是通過(guò)肝細(xì)胞來(lái)源cfDNA比例或每毫升肝細(xì)胞基因組當(dāng)量來(lái)檢測(cè)。使用561（基因組當(dāng)量/mL）的肝源性特異性cfDNA標(biāo)記物，檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移和肝損傷的特異性和靈敏度分別為95%和35%。此外，肝細(xì)胞cfDNA水平能夠區(qū)分有無(wú)肝轉(zhuǎn)移的4期癌癥患者（AUC=0.81，95%置信區(qū)間0.73-0.89，P<0.0001）。另一項(xiàng)研究描述了一種通過(guò)基于攜帶肝細(xì)胞特異性甲基化模式的cfDNA片段的定量鑒定肝細(xì)胞中特異性非甲基化的三個(gè)基因組位點(diǎn)（ITIH4，IGF2R和VTN）來(lái)檢測(cè)急性肝細(xì)胞死亡的方法。通過(guò)ddPCR分析了來(lái)自健康個(gè)體、肝移植患者、肝臟供體、敗血癥患者和杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的血液樣本，結(jié)果表明，這三種肝細(xì)胞來(lái)源的cfDNA分析可以提供有關(guān)肝細(xì)胞死亡的特定和敏感信息。它提供了肝損傷的近實(shí)時(shí)指示，并可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝損傷。
腎臟
基于甲基化的檢測(cè)方法已越來(lái)越多地用于檢測(cè)腎臟損傷并了解與腎臟疾病相關(guān)的潛在分子機(jī)制。在腎臟患者中觀察到特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。在人類急性腎損傷的研究中，通過(guò)焦磷酸測(cè)序評(píng)估了健康對(duì)照組和急性腎損傷患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因啟動(dòng)子區(qū)四個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因啟動(dòng)子在全基因組模式中高于健康對(duì)照組（P<0.0001），表明KLK1基因甲基化有可能成為監(jiān)測(cè)腎損傷的標(biāo)志物。在另一項(xiàng)研究中，手術(shù)后第二天，通過(guò)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)到13名死者和10名活體腎移植受者以及65名健康對(duì)照者尿液DNA中兩個(gè)基因啟動(dòng)子（DAPK和CALCA）的異常甲基化，移植受者尿液中發(fā)現(xiàn)CALCA基因啟動(dòng)子異常甲基化的可能性明顯高于健康對(duì)照組（100%比31%；P<0.0001）。與活體供體移植相比，死亡患者尿液中鈣質(zhì)高甲基化增加（21.60） ± 12.5比12.19 ± 4.7條；P = 0.04）。此外，與急性排斥反應(yīng)和緩慢或快速移植功能相比，活檢證實(shí)的急性腎小管壞死患者的尿鈣異常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9、13.87±6.49、17.17±13.4；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7；P=0.5）。這些結(jié)果表明，尿DAPK和CALCA基因表觀遺傳學(xué)是一種有前途的急性缺血性損傷生物標(biāo)志物腎移植方法。在一項(xiàng)針對(duì)腎移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA，以了解感染與腎組織損傷之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，移植后組織特異性cfDNA尿液絕對(duì)濃度由于應(yīng)激損傷而增加，但在沒(méi)有感染的10天后恢復(fù)到基線。腎病合并BK病毒感染患者的腎源性cfDNA水平顯著高于正常人和單純BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）。此外，細(xì)菌感染患者的膀胱和白細(xì)胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染與組織損傷之間可能存在相關(guān)性。cfDNA片段大小譜可以提供一個(gè)指標(biāo)，通過(guò)該指標(biāo)可以對(duì)具有不同感染癥狀的患者進(jìn)行分層。這些發(fā)現(xiàn)表明，分析cfDNA水平可以提高我們對(duì)感染相關(guān)腎損傷的理解，并可能導(dǎo)致更好的診斷工具和治療方法。
心臟
基于cfDNA甲基化的檢測(cè)已被用于檢測(cè)各種情況下的心臟損傷，包括心臟直視手術(shù)和MI（心肌梗塞）。一項(xiàng)新的研究評(píng)估了cfDNA分子的六個(gè)非甲基化位點(diǎn)作為心臟直視手術(shù)后心臟損傷的標(biāo)志物。使用六種心肌細(xì)胞特異性DNA非甲基化標(biāo)記物檢測(cè)42名接受心臟直視手術(shù)的嬰兒血漿中的心臟cfDNA。手術(shù)后心臟cfDNA升高，反映了與手術(shù)直接相關(guān)的組織損傷，大多數(shù)患者術(shù)后cfDNA降低。本研究還使用心臟cfDNA水平來(lái)預(yù)測(cè)手術(shù)結(jié)果，選擇機(jī)械通氣持續(xù)時(shí)間（大于或小于24小時(shí)）和最大VIS（大于或小于20小時(shí)），并使用ROC（接受者操作特征）曲線作為臨床結(jié)果。作為機(jī)械通氣持續(xù)時(shí)間或最大VIS的預(yù)測(cè)指標(biāo)，術(shù)后6小時(shí)心臟cfDNA的AUC分別為0.7475和0.7555。類似地，在另一項(xiàng)研究中鑒定出心肌細(xì)胞甲基化標(biāo)記物（FAM101A）。ddPCR用于檢測(cè)完全未甲基化的FAM101A的血漿cfDNA濃度，其可以靈敏且特異性地檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷。膿毒癥患者的臨床觀察表明，心臟cfDNA水平不受腎臟或肝臟損傷的顯著影響。Jie Ren等人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌損傷發(fā)生時(shí)，cfDNA被釋放并鑒定出位于CORO6、CACNA1C（兩個(gè)位點(diǎn)）、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六個(gè)CGCGCGG位點(diǎn)，顯示出心臟特異性高甲基化模式。在這些標(biāo)記物中，CORO6在心臟中顯示出最特異性甲基化模式。繼續(xù)研究針對(duì)該特定位點(diǎn)的ddPCR測(cè)定法的開(kāi)發(fā)，該測(cè)定法有效地檢測(cè)了MI患者入院時(shí)cfDNA中心臟損傷的信號(hào)。
肺
基于肺器官特異性cfDNA甲基化檢測(cè)已被用于檢測(cè)各種情況下的肺損傷，包括慢性阻塞性肺病、肺癌、肺結(jié)節(jié)和支氣管檢查后。在2022年的研究中鑒定了17個(gè)具有肺特異性甲基化模式位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，并將其用于評(píng)估健康志愿者和肺部疾病患者血漿中肺源性cfDNA。結(jié)果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化標(biāo)記允許對(duì)肺源性cfDNA進(jìn)行突變獨(dú)立、靈敏和特異性檢測(cè)，從而報(bào)告正在進(jìn)行的肺損傷。Wenhua Liang等人開(kāi)發(fā)了一種新的非侵入性診斷方法，該方法基于肺損傷釋放的cfDNA甲基化分析中的9種標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)早期肺癌并將肺癌與良性肺結(jié)節(jié)區(qū)分開(kāi)，該模型特異性達(dá)到93.2%。這九個(gè)標(biāo)記是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667、cg04175417、cg21962423、cg23156742、cg06287318、cg21963643、cg07568344和cg12545252。
腦
在2022年探索側(cè)支組織損傷的液體活檢研究中，還鑒定了10個(gè)基因組位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在神經(jīng)元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形膠質(zhì)細(xì)胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化。來(lái)自每種腦細(xì)胞類型的信號(hào)產(chǎn)生ROC曲線，每種腦細(xì)胞類型的標(biāo)志物都能夠識(shí)別腦轉(zhuǎn)移患者的血漿，AUC為0.72-0.81，神經(jīng)元標(biāo)志物的95%特異性、靈敏度為17.2%，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的95%特異性、靈敏度為13.8%。
胰腺
甲基化組織研究已經(jīng)能夠在器官中定位特定細(xì)胞類型，并且可以通過(guò)cfDNA甲基化分析檢測(cè)細(xì)胞損傷。例如，在血漿胰腺β細(xì)胞特異性cfDNA的研究中，發(fā)現(xiàn)70%的β細(xì)胞中有六種特異性生物標(biāo)志物（Fbxl19、Mtg1、Leng8、Zc3h3、INS、INS反義）完全未甲基化，其余30%表現(xiàn)出一個(gè)或兩個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化。該研究發(fā)現(xiàn)胰島移植后胰島β細(xì)胞中cfDNA甲基化標(biāo)志物顯著升高，反映了β細(xì)胞的損傷和死亡。此外，鑒于β細(xì)胞中未甲基化INS-CpG位點(diǎn)頻率增加，細(xì)胞死亡后釋放到循環(huán)中的未甲基化與甲基化INS-DNA比例反映了β細(xì)胞死亡。一項(xiàng)研究在編碼PRMT1染色質(zhì)靶標(biāo)（CHTOP）的基因內(nèi)鑒定了一個(gè)基因內(nèi)CpG位點(diǎn)，該位點(diǎn)對(duì)INS具有互補(bǔ)的組織特異性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年檢測(cè)胰島損傷的信心。兩種未甲基化生物標(biāo)志物組合的特異性高達(dá)100%。
肌肉
肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。目前，尚無(wú)確定的ALS循環(huán)生物標(biāo)志物。因此，很難監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展并有效評(píng)估治療反應(yīng)。cfDNA提供了一個(gè)檢測(cè)ALS細(xì)胞死亡的機(jī)會(huì)，填補(bǔ)這些空白。在一項(xiàng)研究中，從20名ALS患者和20名對(duì)照中分離出血漿cfDNA，與對(duì)照組相比，cfDNA用于鑒定ALS患者RHBDF2基因中的新型差異甲基化標(biāo)記。該研究進(jìn)行了ROC分析，以確定RHBDF2基因ALS的診斷效果。其中，RHBDF2基因具有兩個(gè)增強(qiáng)子區(qū)域，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC為0.724（CI 0.559-0.888；P=0.017），CpG2的AUC為0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）。區(qū)分ALS患者和對(duì)照組的最佳閾值為CpG1的65.97%（靈敏度=0.850，特異性=0.526）和CpG2的83.26%（靈敏度=0.800，特異性=0.474）。在現(xiàn)有研究中，針對(duì)甲基化cfDNA開(kāi)發(fā)了一種高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通過(guò)期望最大化進(jìn)行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS參考數(shù)據(jù)，允許低覆蓋率和噪聲數(shù)據(jù)。在該研究中，使用CelFiE從ALS患者和年齡匹配的對(duì)照中檢測(cè)到cfDNA。ALS和對(duì)照中cfDNA的總體豐度顯示出顯著差異。ALS組（n=28，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和對(duì)照組（n=25，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎縮側(cè)索硬化組（ALS組）骨骼肌比例估計(jì)值與對(duì)照組相比有顯著性差異（P=5.02×10-2）�？傊�，這些結(jié)果表明cfDNA是鑒定肌肉萎縮和死亡的第一個(gè)定量生物標(biāo)志物的有希望的方向，這是ALS的標(biāo)志。
總的來(lái)說(shuō)，人們對(duì)使用基于甲基化檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)器官和組織損傷的跡象越來(lái)越感興趣，并且在各種情況下發(fā)現(xiàn)了許多有希望的標(biāo)記物（圖3）。然而，需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證這些組織特異性甲基化標(biāo)記，并開(kāi)發(fā)有效的臨床診斷和預(yù)后工具。
從組織器官損傷特異性cfDNA甲基化標(biāo)志物鑒定到臨床檢測(cè)路徑
基于甲基化的損傷檢測(cè)依賴于組織和器官損傷后DNA甲基化模式變化。甲基化模式對(duì)于每種細(xì)胞類型都是特異性的，在同一個(gè)體內(nèi)部和同一細(xì)胞類型中保守，并且在生理或病理?xiàng)l件下高度穩(wěn)定。因此有可能利用與組織和器官損傷相關(guān)的特定cfDNA甲基化模式來(lái)鑒定起源組織并推斷組織和器官損傷的程度。鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記及其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用需要多步驟方法。然而，鑒于新生物標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)和提出，建立一個(gè)強(qiáng)大的生物標(biāo)志物驗(yàn)證和認(rèn)證系統(tǒng)以確保廣泛接受和正確使用成為當(dāng)務(wù)之急。遵循生物標(biāo)志物認(rèn)證的各種原則，推斷鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)志物并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)過(guò)程可能需要幾個(gè)不同的階段，如圖4所示。值得注意的是，利用甲基化分析進(jìn)行組織損傷檢測(cè)仍處于早期研究階段。到目前為止，還沒(méi)有進(jìn)行臨床研究，也沒(méi)有將商業(yè)產(chǎn)品引入臨床環(huán)境。
圖4：cfDNA甲基化檢測(cè)組織器官損傷的發(fā)展路徑。該路徑概述了將潛在標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為診斷和監(jiān)測(cè)組織和器官損傷的臨床有用工具所必需的研究和開(kāi)發(fā)進(jìn)展
鑒定和驗(yàn)證潛在的甲基化標(biāo)記
美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對(duì)生物標(biāo)志物的使用設(shè)定了四個(gè)類別：預(yù)后性、預(yù)測(cè)性、反應(yīng)指示性和療效反應(yīng)性（表2）。首先，通過(guò)進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，并確定與組織和器官損傷相關(guān)的潛在甲基化標(biāo)志物。這可以通過(guò)響應(yīng)損傷的甲基化變化的研究或者已經(jīng)鑒定與健康組織相比患病組織中的DMR（差異甲基化區(qū)域）的研究來(lái)完成。例如在肝損傷生物標(biāo)志物的研究中，通過(guò)檢查WGBS數(shù)據(jù)并鑒定差異甲基化或差異非甲基化區(qū)域來(lái)選擇肝細(xì)胞特異性CpG位點(diǎn)。為了選擇高甲基化標(biāo)記，確定了肝細(xì)胞樣品的75th百分位數(shù)和所有非肝細(xì)胞樣本的5th百分位數(shù)之間差異超過(guò)0.5的區(qū)域。對(duì)于低甲基化標(biāo)記物，需要在95th和20th百分位數(shù)之間有0.5的差異。通過(guò)這種方式，總共篩選出三種肝細(xì)胞標(biāo)志物（cg02396797、cg030646442、cg21178851）。甲基化DNA數(shù)據(jù)庫(kù)是研究與組織損傷相關(guān)的DNA甲基化模式的寶貴資源。這些數(shù)據(jù)庫(kù)可用于鑒定生物標(biāo)志物、理解分子機(jī)制、評(píng)估嚴(yán)重程度、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)以及研究環(huán)境和生活方式因素。數(shù)據(jù)庫(kù)包括參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)、癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（表3）。這些數(shù)據(jù)庫(kù)為有興趣鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的甲基化標(biāo)記的研究人員提供了寶貴的資源。
表2：FDA生物標(biāo)志物分類表3：常見(jiàn)DNA甲基化數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容和網(wǎng)站建立檢測(cè)分析
一旦確定了潛在的甲基化標(biāo)記，就需要開(kāi)發(fā)一種甲基化檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)這些標(biāo)記中的甲基化變化。根據(jù)所分析的特定標(biāo)記，檢測(cè)方法可以基于不同的技術(shù)，例如MSP（甲基化特異性PCR）、焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）、WGBS（全基因組甲基化測(cè)序）或DNA甲基化芯片。設(shè)計(jì)分析方法后，需要優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)，包括優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、退火溫度（annealing temperature）、循環(huán)條件和檢測(cè)方法等檢測(cè)參數(shù)，以確保準(zhǔn)確可靠地檢測(cè)已鑒定標(biāo)記中的甲基化變化。
例如Miguel Waterhouse開(kāi)發(fā)了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化測(cè)定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的組織損傷。同樣Tulsi K.Mehta等人設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增CALCA基因的引物和探針，以開(kāi)發(fā)一種qPCR（定量PCR）檢測(cè)方法，該方法有望用于評(píng)估移植環(huán)境中的急性腎損傷。在人類急性腎損傷的研究中，通過(guò)焦磷酸測(cè)序評(píng)估了KLK1基因的四個(gè)連續(xù)CpG甲基化，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-203bp至-135bp之間。在cfDNA甲基化研究中，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序來(lái)檢測(cè)cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化狀態(tài)，其中甲基化敏感的TaqMan探針用于分析亞硫酸氫鹽處理的cfDNA。探針的有限長(zhǎng)度（最多30 bp）決定了它們只能覆蓋2-4個(gè)提供信息的CpG位點(diǎn)。IGF2R位點(diǎn)覆蓋了四個(gè)CpG。VTN位點(diǎn)的探針中只覆蓋兩個(gè)CpGs ，預(yù)測(cè)非肝組織DNA中相對(duì)較高的噪聲頻率（陽(yáng)性液滴）。設(shè)計(jì)了兩個(gè)TaqMan探針以提高特異性，每個(gè)探針都從VTN位點(diǎn)相同擴(kuò)增的100 bp片段中鑒定出不同嘧啶簇（每個(gè)簇包含兩個(gè)CpG位點(diǎn)）中的甲基化缺失，并且每個(gè)探針都用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記。
分析有效性
分析有效性是驗(yàn)證檢測(cè)方法的一個(gè)重要方面，該檢測(cè)方法評(píng)估所開(kāi)發(fā)測(cè)定的準(zhǔn)確性和可靠性，包括精確度、靈敏度和特異性。為了確保所開(kāi)發(fā)的甲基化檢測(cè)方法的分析有效性，應(yīng)采取以下步驟：
精確度評(píng)估：使用已知甲基化狀態(tài)的對(duì)照樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的精確度。通過(guò)分析重復(fù)樣品來(lái)計(jì)算內(nèi)部精確度和外部精確度，以確定方法的精確度。
靈敏度評(píng)估：使用已知甲基化水平較低或甲基化變化較小的樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的靈敏度。評(píng)估該方法準(zhǔn)確檢測(cè)微小甲基化變化的能力。
特異性評(píng)估：使用具有不同甲基化模式或來(lái)自不同來(lái)源的樣品，評(píng)估檢測(cè)方法的特異性。確定該方法準(zhǔn)確檢測(cè)甲基化變化而無(wú)假陽(yáng)性的能力。
使用具有已知甲基化狀態(tài)的對(duì)照樣品驗(yàn)證開(kāi)發(fā)的測(cè)定法有助于建立檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。這有助于評(píng)估該方法在甲基化檢測(cè)中的性能，并為其臨床應(yīng)用提供可靠的基礎(chǔ)。
臨床有效性
在建立分析有效性后，會(huì)啟動(dòng)臨床研究以建立臨床有效性：證明生物標(biāo)志物和檢測(cè)方法適合特定使用背景的目的，即分析結(jié)果將為醫(yī)療決策提供信息。應(yīng)使用臨床樣品評(píng)估所開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法的臨床有效性，例如從具有特定組織或器官損傷的患者獲得的血液或組織樣品。該驗(yàn)證過(guò)程旨在確定該測(cè)定是否可以有效區(qū)分有損傷和無(wú)損傷患者，并評(píng)估損傷個(gè)體的臨床靈敏度、臨床特異性和檢出率。臨床靈敏度是指測(cè)定正確鑒定具有特定組織或器官損傷的個(gè)體的能力，而臨床特異性是指測(cè)定正確識(shí)別沒(méi)有損傷的個(gè)體的能力。應(yīng)評(píng)估該測(cè)定的靈敏度和特異性，以確定其在臨床環(huán)境中的準(zhǔn)確性。此外，應(yīng)評(píng)估受傷個(gè)體的檢出率，這反映了臨床診斷為受傷的患者中陽(yáng)性結(jié)果的比例。這些信息可以幫助評(píng)估檢測(cè)方法在檢測(cè)預(yù)期患者群體中特定組織或器官損傷方面的性能。
例如，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化檢測(cè)方法在28名急性移植物抗宿主�。╝GvHD）患者和11名無(wú)相關(guān)癥狀的患者中進(jìn)行了臨床驗(yàn)證，區(qū)分肝臟aGvHD與非aGvHD的最佳閾值為1.5（logPTK2拷貝/mL血漿；靈敏度：0.928；特異性：0.910）。同樣，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供體、85名局部癌癥（非肝臟）患者、55名非肝臟轉(zhuǎn)移性癌癥患者和63名有肝臟轉(zhuǎn)移的癌癥患者，以驗(yàn)證基于cfDNA PCR測(cè)序分析的檢測(cè)方法在區(qū)分肝臟轉(zhuǎn)移方面的表現(xiàn)。結(jié)果表明，通過(guò)這種方法檢測(cè)到的肝細(xì)胞的AUC濃度為0.81（95%置信區(qū)間=0.74–0.87，P= 0.0001）。肝臟轉(zhuǎn)移檢測(cè)的特異性和靈敏度分別為95%和35%。
臨床效用
臨床效用是指在考慮PPV（陽(yáng)性預(yù)測(cè)值）、NVP（陰性預(yù)測(cè)值）和成本等因素下，評(píng)估患者檢測(cè)中開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法的成本效益。臨床效用的評(píng)估可以考慮多種因素，包括但不限于以下因素。
診斷準(zhǔn)確性：評(píng)估甲基化檢測(cè)方法在正確鑒定患者組織或器官損傷方面的靈敏度、特異性、PPV和NPV。臨床影響：評(píng)估甲基化檢測(cè)方法對(duì)治療決策和患者管理的影響，例如它是否有助于選擇適當(dāng)?shù)闹委熯x項(xiàng)、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)或預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)。
成本效益：考慮與甲基化檢測(cè)過(guò)程相關(guān)的成本，包括樣本收集、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋，并將其與潛在的益處進(jìn)行權(quán)衡，如改善患者結(jié)果、降低醫(yī)療保健成本和提高患者滿意度。
可行性和可擴(kuò)展性：評(píng)估在臨床環(huán)境中實(shí)施甲基化檢測(cè)方法的實(shí)際可行性，包括樣本收集的便利性、所需的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施和專業(yè)知識(shí)，以及擴(kuò)展到更大患者人群的可擴(kuò)展性。
比較效果：在準(zhǔn)確性、臨床影響和成本效益方面，將甲基化檢測(cè)方法與現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法或替代方法進(jìn)行比較。
倫理和法律考慮：在評(píng)估臨床效用時(shí)，考慮倫理和法律考慮因素，如患者隱私、知情同意和遵守監(jiān)管要求。
總之，鑒定與組織和器官損傷相關(guān)的特定甲基化標(biāo)記物，并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)，需要一種嚴(yán)格和系統(tǒng)的方法，涉及多個(gè)研究、驗(yàn)證和檢測(cè)階段。然而，值得注意的是，目前使用甲基化分析進(jìn)行組織損傷檢測(cè)仍處于研究的早期階段，迄今為止，尚未進(jìn)行臨床研究，也未在臨床環(huán)境中實(shí)施任何商業(yè)產(chǎn)品。
研究人員、臨床醫(yī)生和行業(yè)伙伴之間的合作對(duì)于確�；诩谆脑\斷檢測(cè)方法的成功開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用非常必要。
挑戰(zhàn)和未來(lái)方向
結(jié)合之前的討論，研究甲基化標(biāo)記物在組織和器官損傷中的應(yīng)用存在一些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)和未來(lái)的研究方向包括：
個(gè)體之間甲基化模式的變異性
根據(jù)之前的大量研究，DNA甲基化模式在個(gè)體之間差異很大，并且與性別、生活環(huán)境和許多其他因素有關(guān)。因此，在臨床上使用DNA甲基化分析來(lái)檢測(cè)組織損傷仍然存在許多困難。這一挑戰(zhàn)的一個(gè)潛在解決方案是使用大規(guī)模研究來(lái)確定跨人群一致的甲基化模式，而不是依賴于單個(gè)標(biāo)記。這種方法可以幫助鑒定不同個(gè)體之間常見(jiàn)的甲基化模式，并且可以用作鑒定與不同組織或器官相關(guān)的甲基化變化的參考。通過(guò)鑒定這些常見(jiàn)模式，研究人員可以減少個(gè)體變異性的影響，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性。另一種方法包括利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)辨別特定類型組織損傷所特有的甲基化模式。這種方法不再僅僅依賴于可能受個(gè)體變異性影響的個(gè)體標(biāo)記，而是側(cè)重于能夠提供更穩(wěn)健和可靠見(jiàn)解的綜合模式。這種方法可以幫助鑒定與特定類型的組織損傷或疾病相關(guān)的甲基化變化。通過(guò)關(guān)注特定的甲基化模式，研究人員可以減少個(gè)體變異性的影響，提高甲基化分析的準(zhǔn)確性。
外部因素對(duì)甲基化模式的影響
由于外部因素對(duì)DNA甲基化模式的影響，這種影響可能會(huì)干擾組織和器官損傷篩查，診斷和治療的決策。未來(lái)的研究可以集中在鑒定和調(diào)控可能影響甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和環(huán)境暴露。可以通過(guò)收集有關(guān)這些因素的詳細(xì)信息的大規(guī)模人群研究以及使用動(dòng)物模型研究特定暴露對(duì)甲基化模式影響的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)完成。例如，當(dāng)Kang Li研究HBV與相關(guān)慢性肝炎之間的關(guān)系以及外周免疫系統(tǒng)的甲基化時(shí)，發(fā)現(xiàn)外周免疫系統(tǒng)的甲基化模式受到外部因素的影響。因此，他們將Bonferroni校正應(yīng)用于代償性肝硬化預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中的潛在混雜因素，并發(fā)現(xiàn)了真正顯著的相關(guān)性。
檢測(cè)方法的技術(shù)局限性和不一致性
現(xiàn)有的甲基化檢測(cè)方法也存在技術(shù)缺陷，例如靈敏度和特異性問(wèn)題。該領(lǐng)域的研究可以集中于開(kāi)發(fā)更靈敏和更具體的檢測(cè)甲基化變化的方法。這可能包括使用納米孔測(cè)序和單細(xì)胞測(cè)序等新技術(shù)，以及開(kāi)發(fā)用于分析甲基化數(shù)據(jù)的改進(jìn)生物信息學(xué)工具。此外，研究可以集中于鑒定和解決現(xiàn)有甲基化檢測(cè)方法的技術(shù)局限性。例如，亞硫酸鹽測(cè)序是檢測(cè)DNA甲基化最常用的方法，由于亞硫酸鹽處理過(guò)程中未甲基化C和DNA損傷的不完全轉(zhuǎn)化，可能會(huì)產(chǎn)生偏差和不準(zhǔn)確。解決這些問(wèn)題的新方法，例如使用替代化學(xué)處理或改進(jìn)的酶轉(zhuǎn)化方法，可以提高甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。此外，研究可以調(diào)查技術(shù)因素對(duì)甲基化分析的影響，例如DNA質(zhì)量和數(shù)量，測(cè)序深度和文庫(kù)制備方法。鑒定和減輕這些因素可以幫助減少變異并提高甲基化研究的可重復(fù)性。
結(jié)論與展望
甲基化檢測(cè)方法在各種情況下表現(xiàn)出檢測(cè)器官和組織損傷方面的巨大潛力。這些檢測(cè)有望檢測(cè)早期損傷、監(jiān)測(cè)組織和器官損傷的進(jìn)展，評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)移植結(jié)果。然而，仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，包括甲基化模式的變異性，可能影響甲基化模式的外部因素以及檢測(cè)方法的技術(shù)局限性。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但人們對(duì)這一領(lǐng)域產(chǎn)生了濃厚的興趣，正在進(jìn)行的研究繼續(xù)確定有前途的標(biāo)記物，并開(kāi)發(fā)有效的診斷和監(jiān)測(cè)工具。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的檢測(cè)有可能通過(guò)分析血液或其他體液來(lái)顯著改善臨床環(huán)境中器官和組織損傷的診斷和管理，這將顯著改善患者獲得診斷測(cè)試和監(jiān)測(cè)。使用基于DNA甲基化的檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)不同治療的反應(yīng)，可以為器官和組織損傷提供個(gè)性化醫(yī)療方法。研究表觀遺傳變化（包括DNA甲基化）在器官和組織損傷的發(fā)展和進(jìn)展中的作用，也將為疾病機(jī)制和潛在的新治療靶點(diǎn)提供見(jiàn)解。
參考文獻(xiàn)：Zhang L, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detection of tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168. pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID: 37858233.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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