文獻(xiàn)信息
西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、陜西省人民醫(yī)院血液科、西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所等單位的研究成果“Clonal MDS/AML cells with enhanced TWIST1 expression reprogram the differentiation of bone marrow MSCs(增強(qiáng)TWIST1表達(dá)的克隆MDS/AML細(xì)胞重編程骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化)在雜志《Redox Biology》(IF:11.4)上發(fā)表。平生公司的離活一體CT(NEMO)在論文中提供了重要的小鼠股骨圖像和定量分析。

 該研究的通訊作者為李想教授；第一作者為李鴻姣博士后和王一教授。

文獻(xiàn)摘要
骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性髓性白血病(AML)患者的骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)通常表現(xiàn)出成骨細(xì)胞生成和脂肪生成之間平衡的轉(zhuǎn)變。這表明BMMSCs可能經(jīng)歷重編程或發(fā)育過程。然而，重編程分化的結(jié)果尚無(wú)定論。本研究采用臨床樣本、共培養(yǎng)模型和小鼠模型來(lái)探討MDS/AML克隆細(xì)胞與BMMSCs分化的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)克隆MDS/AML細(xì)胞促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化并抑制成骨分化，從而促進(jìn)MDS的擴(kuò)增。采用蛋白質(zhì)譜和細(xì)胞因子陣列技術(shù)鑒定到驅(qū)動(dòng)MDS/AML中BMMSCs分化的分子。機(jī)制上，MDS/AML克隆細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子TWIST1誘導(dǎo)MDS/AML細(xì)胞分泌更多IFN-γ， IFN-γ可通過STAT1依賴的方式誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂分化增強(qiáng)，成骨分化受到抑制�？傊�，作者的研究結(jié)果表明，靶向惡性克隆細(xì)胞中的驅(qū)動(dòng)癌基因，如TWIST1，可能通過重塑周圍骨髓微環(huán)境，為治療MDS/AML和其他造血惡性腫瘤提供新的治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物研究
建立患者源性異種移植模型(PDXs)， 6至8周齡B-NSG™小鼠受到180cGy的輻射。如前所述，將HD或MDS/AML患者骨髓中的2×10⁶個(gè)單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射到NSG小鼠中。注射后每周采集尾外周血(100μL)，流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)2×10⁵個(gè)單核細(xì)胞，抗體為人CD45抗體。8周后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂死，收集股骨，評(píng)估骨修復(fù)和骨質(zhì)疏松。

 在異種移植實(shí)驗(yàn)中，6至8周齡的C57BL/6小鼠接受3Gy的輻射。照射后12h內(nèi)，將KG1a細(xì)胞或過表達(dá)TWIST1的KG1a(KG1a-TWIST1)細(xì)胞(5×10⁶)經(jīng)靜脈注射到小鼠BM(骨髓)中。小鼠每周用IFN-γ(2g/kg)或氟達(dá)拉濱(1g/kg)治療3次。注射后1周、3周采集外周血，單核細(xì)胞抗cd45抗體染色，流式細(xì)胞儀分析。注射3周后，小鼠對(duì)其實(shí)施安樂死，并收集股骨。
 顯微CT評(píng)價(jià)骨結(jié)構(gòu)

小鼠安樂死后，取出股骨，在4%新鮮多聚甲醛中固定48h。用微CT掃描儀(NEMO Micro-CT scan, NMC-100, 平生醫(yī)療科技有限公司)掃描股骨，分辨率為16μm，脛骨掃描分辨率為10μm。利用Avatar軟件重建股骨的三維圖像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
AML/MDS中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成脂分化潛能改變
注射MDS/AML患者單核細(xì)胞的小鼠股骨出現(xiàn)骨小梁明顯缺失(圖C&D)，骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和骨小梁數(shù)量(Tb.N)降低，骨小梁分離(Tb.Sp)增大(圖1E)。HE染色顯示MDS/AML單核細(xì)胞小鼠BM中脂肪細(xì)胞豐度較高(圖1F)。LSL-Nras^G12D與Mx1-Cre雜交的Nras^G12D-cre^+/-小鼠可表現(xiàn)出MDS表型，其特征為白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、血紅蛋白(HGB)降低和脾臟增大[27](圖1G, S1C-E)。在這些Nras^G12D-cre^+/-小鼠的BM中觀察到自發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(圖1H)，小梁BV/TV和Tb.N和更高的Tb.Sp，與WT對(duì)照相比(圖1I)。
圖1(C) PDX小鼠模型建立過程示意圖。(D)微CT觀察小鼠股骨。(E)分析股骨骨密度，以骨體積/總體積(BV/TV)、小梁數(shù)(Tb.N)、小梁間距(Tb.Sp)等參數(shù)表示。(F) HDs或MDS/AML患者單核細(xì)胞注射后的股骨HE染色。標(biāo)尺，50μm。(G) Nras^G12D轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立過程示意圖。(H)小鼠股骨來(lái)源于MX1-cre^+/−和Nras^G12D-cre^+/−。(I)BV/TV, Tb.N和Tb.Sp來(lái)源于MX1-cre^+/-和Nras^G12D-cre^+/-。(J)MX1-cre^+/−和Nras^G12D-cre^+/−衍生的股骨HE染色。

克隆細(xì)胞中TWIST1對(duì)BMMSC分化的影響
與作者之前的研究一致，轉(zhuǎn)錄因子TWIST1在MDS中表達(dá)升高，在AML中表達(dá)加劇(圖3A)。TWIST1的高表達(dá)與AML預(yù)后不良有關(guān)(圖3B)。與KG1a細(xì)胞相比，注射TWIST1過表達(dá)的KG1a細(xì)胞(稱為KG1a-TWIST1)導(dǎo)致骨丟失，而注射TWIST1敲除的KG1a細(xì)胞(稱為KG1a-ko-TWIST1)導(dǎo)致體內(nèi)骨豐度(圖C-F)。

圖3惡性克隆細(xì)胞中TWIST1表達(dá)對(duì)BMMSC分化的影響。(A)HDs(n=10)、MDS(n=10)和AML(n=21)患者單核細(xì)胞中TWIST1 mRNA水平的表達(dá)。(B) Kaplan-Meier總生存曲線，用于評(píng)估PrognoScan數(shù)據(jù)庫(kù)中TWIST1的預(yù)后意義。(C)建立異種移植小鼠模型的過程示意圖。(E)股骨骨密度用BV/TV、Tb.N、Tb.Sp表示。

TWIST1誘導(dǎo)IFN-γ升高，使BMMSCs中ROS水平升高
經(jīng)IFN-γ處理后，BMMSCs的成骨分化受到明顯抑制，而成脂分化得到促進(jìn)(圖5B)。經(jīng)KG1a細(xì)胞和IFN-γ照射的小鼠(圖5C)成骨分化受到明顯抑制，脂肪細(xì)胞豐度增加，RunX2表達(dá)降低，PPAR-γ表達(dá)升高(圖5D-F)。
圖5 IFN-γ的分泌受TWIST1的影響 (C)異種移植小鼠模型示意圖。成年C57BL/6小鼠經(jīng)3Gy照射后，腹腔注射2×0⁶ KG1a細(xì)胞和IFN-γ (2mg/kg)，每周3次。第21天處死小鼠，用Micro-CT對(duì)股骨進(jìn)行評(píng)價(jià)。(D)Micro-CT觀察小鼠股骨。(E)注射KG1a細(xì)胞和IFN-γ后小鼠股骨骨密度變化。

氟達(dá)拉濱和ROS清除劑可逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化缺陷
接下來(lái)，作者發(fā)現(xiàn)氟達(dá)拉濱治療的BMMSCs顯著抑制骨質(zhì)疏松，但減少脂肪生成(圖7A)，表明STAT1信號(hào)通路對(duì)BMMSCs分化有影響。然后，給照射后的小鼠注射KG1a-TWIST1細(xì)胞，并用氟達(dá)拉濱處理(圖7B)。骨小梁BV/TV和Tb的增加，明顯促進(jìn)了成骨分化 (圖C&D)。HE染色顯示氟達(dá)拉濱處理小鼠BM中脂肪細(xì)胞減少(圖7E)。然后，作者將一種ROS清除劑N-Actyl-L-cysteine(NAC),用于注射KG1a-TWIST1的小鼠。NAC處理顯著促進(jìn)NAC處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨并減少脂肪生成(圖7G-J)。
 圖7 Stat1信號(hào)通路抑制劑和ROS清除劑可逆轉(zhuǎn)分化缺陷。

(B)異種移植小鼠模型示意圖。成年C57BL/6小鼠經(jīng)3Gy照射后，腹腔注射2×10⁶ KG1a-TWIST1細(xì)胞和氟達(dá)拉賓(1mg/kg)，每周3次。第21天處死小鼠，用Micro-CT對(duì)股骨進(jìn)行評(píng)價(jià)。(C)Micro-CT觀察小鼠股骨。(D)注射KG1a細(xì)胞和氟達(dá)拉濱小鼠股骨骨密度分析。(E)注射KG1a-TWIST1細(xì)胞和氟達(dá)拉濱小鼠股骨HE染色。(F)10mM NAC處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成脂或成骨分化培養(yǎng)基孵育。(G)異種移植小鼠模型示意圖。成年C57BL/6小鼠經(jīng)3Gy照射后，注射2×10⁶ KG1a-TWIST1細(xì)胞，每天口服含NAC(7g/L)的水。第21天處死小鼠，用Micro-CT對(duì)股骨進(jìn)行評(píng)價(jià)。(H)Micro-CT觀察小鼠股骨。(1)KG1a-TWIST1和NAC處理小鼠股骨骨密度分析。

文獻(xiàn)結(jié)論
不斷發(fā)展的證據(jù)表明，BMMSCs以疾病特異性的方式在白血病的發(fā)生、進(jìn)展和化療耐藥中起關(guān)鍵作用。作者的研究表明，TWIST1增強(qiáng)的MDS/AML克隆細(xì)胞可抑制骨系發(fā)育和骨形成，同時(shí)通過分泌IFN-γ促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。這種BMMSCs的不平衡分化創(chuàng)造了一個(gè)促腫瘤微環(huán)境，支持MDS/AML的生存和生長(zhǎng)。因此，在惡性克隆細(xì)胞中靶向癌基因，如TWIST1，可能通過重塑BMME來(lái)改善MDS/AML和其他造血惡性腫瘤的治療策略。

使用設(shè)備

         

 Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)

   影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）