scRNA‑seq圖譜在揭示浸潤性5ALA代謝細胞的獨特分子特征中的應用
影響因子：12.3
主要技術：IHC、RNA-seq、scRNA‑seq、ST
導語
來自基因組和轉錄變異的時空異質性被發(fā)現(xiàn)有助于異檸檬酸脫氫酶-1野生型膠質母細胞瘤(GBM)復發(fā)前和復發(fā)后的亞型轉換。利用5-氨基乙酰丙酸(5ALA)的熒光引導神經外科切除術可以術中顯示磁共振成像增強區(qū)域外的浸潤性腫瘤。促進5ALA代謝為熒光活性PpIX的腫瘤細胞群和功能狀態(tài)尚不清楚。5ALA代謝(5ALA +)細胞與術后殘留病變的空間接近性使得5ALA +生物學成為GBM復發(fā)的早期先驗指標，但目前對其了解甚少。
方法
對IDH-wtGBM患者(N = 10)未分類的Core、Rim、侵襲性邊緣組織和FACE分離的侵襲性邊緣5ALA + /5ALA−細胞進行了空間分辨體RNA譜分析(SPRP)，并結合組織學、放射學和雙光子激發(fā)熒光顯微鏡分析。分別使用CIBERSORTx和UCell富集算法對SPRP進行反卷積和功能分析。通過分析獨立IDH-wt GBM隊列(N = 16)的空間轉錄組學，我們進一步研究了5ALA +富集區(qū)域的空間結構。最后，使用Cox比例風險模型對大型GBM隊列進行了生存分析。
結果
結合單細胞和空間轉錄組的SPRP分析發(fā)現(xiàn)GBM分子亞型異質性可能以細胞類型特異性的方式表現(xiàn)。感染型5ALA+細胞群具有轉錄一致的GBM和髓系細胞，具有間充質亞型、傷口反應活躍和糖酵解代謝特征，位于侵襲性邊緣，與腫瘤核心不同。PpIX熒光可以單獨用來切除腫瘤核心以外的免疫反應區(qū)。最后，5ALA+基因與GBM的低生存率和復發(fā)率相關，表明該轉變從原發(fā)性到復發(fā)性GBM不是離散的，而是一個連續(xù)體，即原發(fā)性膨脹的5ALA+殘余腫瘤細胞更接近于最終復發(fā)的GBM。
技術服務
IHC、RNA-seq、scRNA‑seq、ST
研究結果
1. 在空間上不同的GBM區(qū)域中癌癥特異性和代謝特征的差異調節(jié)
分析了10例接受5ALA指導手術的GBM患者的組織樣本(代表空間不同的區(qū)域(核心、邊緣、浸潤邊緣))中SPRP衍生的RNA-seq數(shù)據(jù)。對代表性患者(N = 2)的蘇木精染色和伊紅染色圖像進行組織學分析，揭示了5ALA +浸潤邊緣的細胞和解剖學特征。對于28例患者，虛線邊界劃分了核心和內緣之間的邊界。在大腦新皮層內觀察到單個腫瘤細胞，神經元正態(tài)分布。細胞腫瘤邊緣外微血管增生，反映腫瘤釋放并滲透到腫瘤邊緣以外的營養(yǎng)因子。對于患者37，在大腦新皮層內觀察到侵襲邊緣內的單個腫瘤細胞，白質血呈正態(tài)分布。低密度腫瘤細胞彌漫性浸潤深部白質。此外，在這一深層白質區(qū)域內觀察到少突膠質細胞、巨噬細胞和星形膠質細胞。
此外，影像學和雙光子激發(fā)熒光顯微鏡分析結果顯示，另一名術前接受5ALA +治療的GBM患者的核心和浸潤邊緣(Inv)在空間上具有不同的性質。與Inv邊緣相比，5ALA誘導的PpIX熒光在核心中占優(yōu)勢。在Inv邊緣，在正常腦細胞的背景下可以看到間歇性的PpIX熒光。這些結果證明了Inv與先前報道的增強區(qū)(ER)和增強邊緣(EM)在空間上的不同。使用DEA來探索5ALA +細胞與Core、Rim、侵襲性切緣和5ALA−細胞之間的差異調控基因。然后進行通路富集分析，5ALA +細胞中NFкB和炎癥反應通路中TNF-α信號的上調。為了確定癌癥相關和代謝途徑，在特定區(qū)域/分選細胞和所有其他區(qū)域/分選細胞之間進行配對設計的基因集富集分析(GSEA)。Core顯示出最多的富集通路，包括上皮-間質轉化(EMT)和缺氧。與核心相似，EMT和缺氧在邊緣高度富集。Core也富含促增殖通路，而Inv中僅富含有絲分裂-紡錘體。對來自GBM患者(N = 36)的組織切片進行Ki-67免疫組化(IHC)，顯示在核心淺層內側區(qū)域有大量增殖細胞，其次是前內側區(qū)域和邊緣區(qū)域。與核心相比，浸潤邊緣顯示出較少的增殖細胞。在核心區(qū)有更多的促增殖通路，這與在該區(qū)域觀察到的增殖細胞數(shù)量增加是一致的。除了核心和邊緣沒有氧化磷酸化外，糖酵解途徑的富集可能是由這些區(qū)域的缺氧條件誘導的。相比之下，未分選的浸潤緣、5ALA +和5ALA分選的細胞均不富集缺氧。侵襲邊緣和5ALA−細胞中氧化磷酸化的富集進一步證實了GBM浸潤邊緣代表一個正常微環(huán)境的證據(jù)。CD31免疫組化也通過顯示Core和Rim高度血管化來強化這一發(fā)現(xiàn)，而侵襲邊緣觀察到低血管化。與先前的DEA結果一致，通過NFкB和炎癥反應途徑的TNF-α信號在5ALA +細胞以及Core和Rim中高度富集。
Fig1. 空間差異GBM區(qū)域差異基因表達分析
2. 5ALA + GBM人群富含間充質亞型、炎癥傷口反應轉錄程序和糖酵解代謝狀態(tài)
為了驗證5ALA +細胞群類似于特定GBM亞型的假設，利用富集分析來鑒定先前由Verhaak等人描述的GBM分子亞型(經典(CL)、神經(NE)、原膜(PN)和間質(MES)。與其他區(qū)域相比，核心和邊緣區(qū)域主要富集CL和PN亞型，特別是5ALA +細胞，而最近修訂的非腫瘤性NE亞型在侵襲性邊緣區(qū)域高度富集。5ALA−細胞主要與NE和PN亞型相關，相比之下，與所有其他區(qū)域相比，5ALA +細胞高度且獨特地富集了MES亞型，特別是5ALA−細胞。
對來自GBM患者(N = 36)的組織進行免疫組化，以測定NeuN的表達，NeuN代表侵襲性邊緣神經元細胞相對于Core和Rim的比例。與浸潤性邊緣相比，核心區(qū)緊隨Rim區(qū)神經元細胞比例最低。在侵襲邊緣觀察到的神經元比例最高，進一步證實了空間分子特征。對顯著調控的前沿基因進行分層聚類分析顯示，相對于5ALA +細胞，CL-和PN特異性基因在Core、Rim和侵襲性切緣中高表達，而NE特異性基因在侵襲性切緣中表達最高。3例患者MES基因表達相對較低，7例患者MES基因表達相對較高。這一結果表明5ALA +人群中存在患者特異性MES基因表達變異性。GSEA顯示了這些轉錄和代謝狀態(tài)的雙重富集，其中發(fā)育狀態(tài)和GPM狀態(tài)在核心和Rim中富集，與所有其他區(qū)域相比，只有發(fā)育程序在侵襲性邊緣中富集。Te MTC狀態(tài)在5ALA−細胞中富集；GPM在5ALA+細胞中富集，表明5ALA+和5ALA−細胞不同，盡管膨脹邊緣微環(huán)境和ALA−細胞的代謝狀態(tài)不同。傷口反應在5ALA+細胞中唯一富集。對于5ALA+細胞，GPM的富集評分最高，其次是Inf。這些結果強調了在空間上不同的GBM區(qū)域和5ALA-ssort細胞中差異轉錄和代謝狀態(tài)的激活。5ALA +細胞可能會保持類似于Core的GPM狀態(tài)。
Fig 2. GBM不同區(qū)域亞型、分子和代謝基因特征的富集
3. 5ALA +群體代表轉錄一致的侵襲性惡性細胞和髓系細胞，具有活躍的間充質亞型和炎癥傷口反應程序
為了驗證惡性GBM細胞可以獲得類似髓細胞的轉錄狀態(tài)的假設，首先通過tSNE分析GBM圖中的惡性和髓系細胞，然后進行Louvain聚類。CNV分析發(fā)現(xiàn)了一組獨特的非整倍體細胞，僅根據(jù)轉錄特征就被注釋為髓系細胞。剩余的髓系細胞主要是二倍體。對非整倍體和二倍體骨髓細胞(N = 132,654)進行了Louvain聚類的tSNE，得到了18個cluster。進行了Fisher精確檢驗，觀察非整倍體和二倍體細胞在cluster中的分布，并確定在特定簇中非整倍體細胞的過度代表。結果顯示，C8非整倍體細胞高度富集。通過計算Ucell評分來評估5ALA +基因標記的富集程度，并隨后將5ALA + Ucell評分映射到兩個髓系細胞群上：髓系非整倍體(MLA)細胞(N = 5171)和二倍體髓樣(DM) (N = 127,483)細胞。
MLA細胞在GPM、MES和tnf - α基因特征方面顯示出更高的UCell評分。MLA和DM細胞與非髓樣惡性細胞相比，都顯示出較高的UCell評分。MLA細胞中5ALA +和相關基因特征的高富集表明，盡管這種非整倍體群體在轉錄上與髓系細胞相似，但可能有助于5ALA +細胞群體的惡性效力。從GBmap數(shù)據(jù)集建立了一個矩陣，隨后使用CIBERSORTx算法從空間分辨的Core和基于5ALA的分類樣本(5ALA +和5ALA-)中反卷積轉錄組。通過CIBERSORTx對分數(shù)的估計顯示，與Core和5ALA -人群相比，5ALA +人群的MLA分數(shù)確實更高。
總的來說，這些數(shù)據(jù)證實了MES細胞狀態(tài)、活躍的inf傷口反應轉錄程序和GPM代謝狀態(tài)在5ALA +細胞中占主導地位。此外，5ALA +細胞可能在分散的病灶內保持缺氧依賴的GPM狀態(tài)，盡管在正常的侵襲性邊緣微環(huán)境中，MTC代謝狀態(tài)占主導地位。
Fig 3. 5ALA +基因在髓樣非整倍體、二倍體髓樣和非髓樣惡性細胞中的富集
5. 5ALA +細胞群類似于表達CD44的癌間充質細胞
5ALA +細胞中gsc衍生的inf傷口反應程序的激活提高了保留干細胞樣轉錄組景觀的可能性。通過基于5ALA +、5ALA−細胞和空間上不同的GBM區(qū)域的大量mRNA表達(SPRP)數(shù)據(jù)估計患者特異性干性指數(shù)(mRNAsi)來找出5ALA +細胞中的干細胞轉錄組特征。具有最高的干性指數(shù)，5ALA +細胞相對于所有未分類的腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出明顯的特征，其中5ALA +細胞與核心和邊緣區(qū)域相比表現(xiàn)出明顯更高的干性特征。將TCGA-GBM樣本(代表腫瘤核心)分層為分子亞型，結果顯示，與5ALA +和5ALA -細胞相比，GBM亞型的mRNAsi較低。利用了來自代表5ALA -細胞的TCGA鄰近非腫瘤組織(NAT)的mRNAsi數(shù)據(jù)，并將其與代表腫瘤核心的TCGA-GBM組織進行了比較。Bootstrap之后的Wilcox測試顯示，與GBM核心相比，NAT區(qū)域的mRNAsi值顯著更高。認識到5ALA +細胞的獨特性，進行了干性與5ALA +特征基因之間的相關性分析。只有23個基因與mRNAsi呈顯著正相關，其他基因(N = 228)與mRNAsi呈顯著負相關。盡管5ALA +群體表現(xiàn)出較高的干性指數(shù)，但由于干性相關基因與5ALA +基因標記之間缺乏顯著的相關性，使得5ALA +細胞的干性特征無法確定。
基于Couturier等人的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的tSNE圖，tSNE分析顯示，富含5ALA +基因標記的細胞與GP和OLC的定位明顯，但與包括截斷的放射狀膠質細胞和癌癥間質細胞在內的混合群體存在顯著重疊。5ALA +可能類似于癌癥間充質細胞，而不是截短的放射狀膠質細胞，但也表明5ALA +細胞群中的細胞異質性。
Fig 4. 5ALA +細胞代表表達CD44的間充質細胞
6. 空間解析轉錄組學揭示了微環(huán)境中存在罕見的浸潤性5ALA +細胞
進一步利用空間分辨轉錄組學(stRNA-seq)對來自獨立IDH-wt GBM患者隊列(N = 16)的組織切片進行分析，研究了容納這些細胞的空間定位和周圍微環(huán)境。選擇ukf# 334作為具有代表性的組織樣本，說明5ALA +轉錄特征的共定位，具有MES和傷口反應基因特征。此外，5ALA +富集的細胞在空間上接近GPM代謝狀態(tài)富集的區(qū)域和缺氧激活區(qū)域。GPM的空間共定位與缺氧密切相關，這為5ALA +細胞活躍的GPM狀態(tài)作為對代謝改變環(huán)境的補償機制提供了合理的解釋。與之前的研究結果一致，5ALA +細胞進一步表現(xiàn)為CD44的高表達。通過空間聚類分析轉錄異質性揭示了不同聚類的存在(N = 11)。C9和C7主要與5ALA +富集區(qū)存在空間重疊，這表明在5ALA +細胞群體中存在異質性轉錄組景觀。5ALA- inv和5ALA- ct在5ALA +和傷口反應基因特征中均富集，而5ALA- inv在MES中富集，進一步證明5ALA +侵襲性邊緣細胞可能經歷向MES亞型的過渡。
為了更深入地了解5ALA +細胞相對于壞死腫瘤核心的定位和空間微環(huán)境的差異，進一步利用stRNA-seq數(shù)據(jù)在特定組織樣本中鑒定5ALA +基因特征富集區(qū)域。選擇了ukf# 313樣本，它代表一個壞死的腫瘤核心，周圍是假乳頭狀細胞，然后是一個CT區(qū)域。CNV的推斷提供了進一步的證據(jù)，表明CT中7號染色體的增加和10號染色體的缺失。GSEA分析顯示，細胞區(qū)域富含5ALA +基因標記的斑點在空間上遠離壞死核心。在樣本ukf# 269中，組織學分析顯示了CT和空間相鄰的NT區(qū)域之間的區(qū)別。CT和NT之間的空間邊界也得到了CNV分析的支持，其中CT的特征是7號染色體的增加和10號染色體的缺失。stRNA-seq分析揭示了CD44表達罕見的5ALA+細胞的存在周圍缺氧微管，遠離壞死核心，與髓系細胞共同定位。
Fig 5. GBM侵襲邊緣罕見浸潤性5ALA +細胞群的鑒定
6. 5ALA +細胞富集的細胞、轉錄和代謝狀態(tài)與腫瘤復發(fā)有關
與復發(fā)腫瘤相比，TCGA原發(fā)腫瘤中沒有富集基因特征，為了進一步研究獨特的5ALA +基因特征對復發(fā)和原發(fā)GBM患者生存的影響，分別對復發(fā)和原發(fā)腫瘤進行了單樣本GSEA (ssGSEA)，以獲得5ALA +基因特征。結合NES計算每個腫瘤樣本的5ALA +基因聯(lián)合標記評分，并與復發(fā)患者和原發(fā)患者的生存數(shù)據(jù)進行相關性分析。對于GLASS的復發(fā)腫瘤隊列，5ALA +基因標記評分與生存率呈顯著負相關，而原發(fā)腫瘤則沒有。多因素回歸分析顯示，5ALA +基因聯(lián)合標記與復發(fā)性GBM患者的較差生存率顯著相關。檢索了來自PDEs的原發(fā)細胞(N = 10,905)和復發(fā)細胞(N = 8833)的scRNA-seq數(shù)據(jù)。tSNE分析結合Louvain聚類，然后將5ALA + UCell評分映射到tSNE圖上，結果表明，在由GBM患者的原發(fā)性和復發(fā)性腫瘤細胞組成的不同聚類中，5ALA +基因特征明顯可見。對比分析證實了之前的假設，即復發(fā)性GBM細胞的5ALA + UCell評分明顯高于原發(fā)細，進一步強調了5ALA +基因標記與GBM復發(fā)之間的關聯(lián)。
綜上所述，5ALA +細胞的富集基因特征與GBM的低生存率和復發(fā)相關，這表明這些特征在腫瘤進展和疾病復發(fā)間隔中可能具有功能影響。
Fig 6. 5ALA +基因特征與GBM患者復發(fā)的關系
參考文獻：
Andrieux, G., Das, T., Griffin, M. et al. Spatially resolved transcriptomic profiles reveal unique defining molecular features of infiltrative 5ALA-metabolizing cells associated with glioblastoma recurrence. Genome Med 15, 48 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01207-1IF: 12.3 Q1
