鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)在免疫沉淀中的應用
鏈霉親和素 (Streptavidin/SA，分子量≈65 kDa，等電點≈6.0)，是從鏈霉菌 Streptomyces Avidinii 培養(yǎng)物中提取的一種分泌性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素是四聚體蛋白，也是一種生物素結(jié)合蛋白，包含四個亞基，每個亞基都有一個生物素結(jié)合位點。一分子鏈霉親和素可以高度特異性地與四分子生物素結(jié)合 (圖 1)，二者的解離常數(shù) (kd) 約為 10-15，這種緊密而特異的結(jié)合非常快速且能夠承受極端的 pH 值、溫度、有機溶劑和變性試劑。
▐ 案例 1：免疫沉淀 (IP)
為了證實 Rab11a 是否在缺氧條件下的 MSC-sEV (間充質(zhì)干細胞來源的小細胞外囊泡)回收中發(fā)揮作用，作者使用了鏈霉親和素磁珠共沉淀生物素標記的 MSC-sEV 及其在 NPC (髓核細胞) 中的相互作用蛋白，而陰性對照組設置為未標記的 MSC-sEV。ALIX 是一種常用的 sEV 標記物，用于檢測免疫共沉淀的 MSC-sEV。作者發(fā)現(xiàn)在常氧組和缺氧組中，Rab11a 均被鏈霉親和素磁珠共沉淀，但在生物素化的 MSC-sEV 或 NPC + 未生物素標記的 MSC-Sev 組中則不然，這表明缺氧下 Rab11a 與內(nèi)化 MSC-sEV 之間的相互作用增強 (圖 2)。
圖 2. 缺氧下 Rab11a 與內(nèi)化 MSC-sEV 之間的相互作用[1]。
▐ 案例 2：染色質(zhì)免疫共沉淀 (CHIP)
作者假設 CnHsf3 可以通過 DNA 結(jié)合域 (DBD) 的直接氧化來激活。為了驗證這一假設，作者使用三種生物素標記的 CnHsf3-線粒體靶向寡核苷酸進行 CHIP 實驗。結(jié)果表明，經(jīng) NaClO (氧化劑) 處理的 CnHsf3 DBD 與所有靶寡核苷酸結(jié)合，而未經(jīng)處理的 CnHsf3 DBD 則表現(xiàn)出未結(jié)合或有限結(jié)合 (圖 3)。進一步的 EMSA 與 SPR 實驗也證實了 CnHsf3 DBD 與線粒體靶向寡核苷酸探針互作，表明 CnHsf3 的功能與其 DBD 的氧化相關(guān)。
圖 3. CnHsf3 DBD 與線粒體靶向寡核苷酸探針互作分析環(huán)[2]。
▐ 案例 3：RNA 免疫沉淀 (RIP)
作者假設 YTHDC1 參與 HaCaT 細胞中 SQSTM1 表達的調(diào)節(jié)。RNA 免疫沉淀 (RIP)-qPCR 實驗表明，YTHDC1 蛋白可以與 SQSTM1 mRNA 相互作用。RNA 親和分離(RNA affinity isolation)，進一步證實了 SQSTM1 mRNA (已生物素化處理) 與YTHDC1 蛋白相互作用 (圖 4)。
圖 4. 正常葡萄糖處理的 HaCaT 細胞中 YTHDC1 蛋白和 SQSTM1 mRNA 的互作分析[3]。
Tips：如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素分子？鏈霉親和素-生物素相互作用是已知最強的蛋白與其他分子間非共價的生物相互作用。許多應用不需要從鏈霉親和素磁珠上解離生物素分子，如上述的 3 個案例。如需要解離，通常情況下都需要非常劇烈的方法 (此時鏈霉親和素已變性)。下述為 2 種方法舉例：
1）解離生物素化核酸：為了從鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在 pH 8.2 的 95% 甲酰胺+ 10 mM EDTA 中孵育磁珠，65°C 孵育 5 分鐘或 90°C 孵育 2 分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。
2）解離生物素化蛋白質(zhì)：對于生物素化蛋白質(zhì)，則可在 0.1% SDS 或 SDS-PAGE 緩沖液中煮沸磁珠 3 分鐘。
一分子鏈霉親和素可以高度特異性地與四分子生物素結(jié)合，從而放大弱信號，通過簡單的工作流程即可提高細胞或組織內(nèi)中低豐度目標的檢測靈敏度。鏈霉親和素可以與多種熒光染料/報告標簽結(jié)合，同時生物素標記抗體、酶的標記率高且不影響蛋白的活性，因此鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)可用于幾乎所有的免疫測定實驗。這些優(yōu)點使鏈霉親和素-生物素標記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的途徑。
例如，熒光標記的鏈霉親和素，如 Vari Fluor 488-Streptavidin，廣泛用于細胞表面標記、熒光細胞分選 (FACS) 和其他熒光檢測成像應用。
圖 5. Vari Fluor 488-Streptavidin 的免疫熒光染色。
除 Vari Fluor 488-Streptavidin 外，MCE 還可以提供多種 Vari Fluor 染料標記的鏈霉親和素。這些 Vari Fluor 染料的發(fā)射光譜覆蓋整個可見光和近紅外光，在多色標記實驗中能夠很容易地進入細胞核和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)并標記靶蛋白，進行成像和分析。
參考文獻：
[1] Bide Tong, et al. Augmenting Intracellular Cargo Delivery of Extracellular Vesicles in Hypoxic Tissues through Inhibiting Hypoxia-Induced Endocytic Recycling. ACS Nano. 2023 Feb 14;17(3):2537-2553.
[2] Xindi Gao, et al. Cryptococcal Hsf3 controls intramitochondrial ROS homeostasis by regulating the respiratory process. Nat Commun. 2022 Sep 15;13(1):5407.
[3] Diefei Liang, et al. m6A reader YTHDC1 modulates autophagy by targeting SQSTM1 in diabetic skin. Autophagy. 2022 Jun;18(6):1318-1337.
