文獻(xiàn)解讀：WWOX基因通過上調(diào)Myc促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的表觀調(diào)控機(jī)制
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一種高侵襲性骨腫瘤，主要影響兒童和青少年。這種惡性腫瘤與不良臨床結(jié)果相關(guān)，尤其是肺轉(zhuǎn)移。由于其罕見性和生物學(xué)異質(zhì)性，對其分子基礎(chǔ)研究有限，阻礙了有效療法的發(fā)展。WW結(jié)構(gòu)域氧化還原酶（WW domain-containing oxidoreductase，WWOX）是一種在人骨肉瘤中經(jīng)常發(fā)生變化的基因，使用Osterix1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雙敲除Wwox和Trp53（DKO）已被證明可加速骨肉瘤發(fā)展。
2024年1月5日，以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rami I. Aqeilan團(tuán)隊(duì)在《cell death & disease》雜志發(fā)表題為“WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc”的研究論文。本研究通過構(gòu)建一個(gè)可追蹤的骨肉瘤小鼠模型，研究了WWOX基因在骨肉瘤發(fā)展中的作用，尤其是Myc基因及其靶基因MCM7的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明，BM MSC可能是骨肉瘤的起源細(xì)胞，且Myc和其靶基因可能是骨肉瘤發(fā)生的早期分子事件，這為骨肉瘤的早期診斷和治療提供了新的視角。
標(biāo)題：WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc（WWOX基因通過上調(diào)Myc促進(jìn)骨肉瘤發(fā)展）
時(shí)間：2024-1-5
期刊：cell death & disease
影響因子：IF 9
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
研究摘要
本研究構(gòu)建了一個(gè)可追蹤的骨肉瘤小鼠模型，該模型通過單敲除Trp53（SKO）或雙敲除Wwox/Trp53（DKO）并表達(dá)tdTomato報(bào)告基因。通過追蹤不同時(shí)間點(diǎn)的Tomato表達(dá)，研究者在非骨肉瘤攜帶小鼠骨髓（bone marrow）間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells ,MSC) （young BM，年輕BM）中檢測到早期的tdTomato陽性細(xì)胞。分析結(jié)果表明雙敲除年輕BM細(xì)胞（DKO yBM）在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出致瘤特性，這些雙敲除年輕BM細(xì)胞的分子和細(xì)胞表征揭示了其與骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的相似性。與單基因敲除年輕BM細(xì)胞相比，雙基因敲除年輕BM細(xì)胞中觀察到Myc及其靶基因上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組變化。Myc的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析揭示了Myc在雙敲除年輕BM細(xì)胞中對Myc靶基因的富集增加，而Myc靶基因在雙敲除的年輕BM細(xì)胞中上調(diào)。雙敲除年輕BM細(xì)胞中WWOX的恢復(fù)降低了Myc蛋白水平。相對于單敲除年輕BM細(xì)胞，MCM7（Myc的一個(gè)已知靶基因）在雙敲除年輕BM中上調(diào)。使用辛伐他�。╯imvastatin）抑制MCM7表達(dá)導(dǎo)致雙敲除young BM細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞生長減少。研究結(jié)果揭示了BM間充質(zhì)干細(xì)胞（BM MSCs）是研究骨肉瘤和Myc及其靶標(biāo)作為WWOX效應(yīng)器和骨肉瘤發(fā)生過程中早期分子事件。
研究結(jié)果
（1）構(gòu)建可追蹤的骨肉瘤小鼠模型
圖1：可追蹤的骨肉瘤細(xì)胞小鼠模型
A.實(shí)驗(yàn)骨肉瘤（OS）小鼠模型的示意圖。
B.Cre陰性（Cre-），Cre陽性（Cre+ WT）和雙敲除（DKo tom）小鼠的基因組PCR。左panel的標(biāo)簽表示引物對，右panel的標(biāo)簽表示預(yù)期的條帶大小。
C.從（1）Cre陰性小鼠，（2）Cre+ WT小鼠，（3）DKO TOM小鼠提取的骨骼熒光顯微鏡圖像。
D.來自Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠的冷凍骨切片的免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色hoechst。
E.2月齡（2m）的Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠BM細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。10.2±2.3表示與同齡Cre-小鼠相比，Cre+ WT和DKO BM中tdTomato陽性細(xì)胞百分比。
F.在Cre+ WT和DKO BM細(xì)胞中，免疫印跡分析對p53、WWOX、p21和tdTomato蛋白在未電離輻射暴露（0分鐘）及電離輻射暴露（IR-10Gy）（30分鐘和120 分鐘）的表達(dá)。（相對于Cre+ WT的定量印跡分析）。
WT：野生型，DKO：雙敲除，BF：bright field，RFP：紅色熒光蛋白（red fluorescent protein），BM：骨髓（bone marrow）。
（2）OS小鼠的骨髓（BM）細(xì)胞具有致瘤性
B.與Cre+WT BM細(xì)胞相比，成對BMT和腫瘤細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)（代表性圖像左圖）（Giemsa染色和熒光顯微鏡圖像），Cre+BM、BMT和腫瘤細(xì)胞的集落數(shù)量的定量右圖（n=3）。
C.與對照上圖相比，NOD/SCID小鼠脛內(nèi)（IT）注射BMT和腫瘤細(xì)胞后發(fā)生的OS腫瘤的代表性圖像，H＆E驗(yàn)證OS中panel的組織學(xué)特征。組織學(xué)驗(yàn)證顯示為成骨細(xì)胞型OS，下panel為腫瘤發(fā)展的免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色hoechst。
D.條形圖表示IT注射對照BM細(xì)胞（對照）、BMT和腫瘤細(xì)胞后出現(xiàn)OS的免疫低下小鼠的百分比。
E.傷口愈合實(shí)驗(yàn)遷移。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度時(shí)間圖（n=3）。
F.創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度的時(shí)間圖（n=3）。
B.腫瘤細(xì)胞（n=3）、成對BM細(xì)胞（BMT）（n=3）與對照組比較的Venn圖。BMT與腫瘤細(xì)胞之間的共有基因?yàn)?64。
C.熱圖顯示對照細(xì)胞和BMT/腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因。
D.通路富集分析。
E.對照組和BMT/腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
（3）young BM（yBM）細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤性
B.年輕非腫瘤攜帶小鼠（yBM-DKO）的BM細(xì)胞、Cre陰性小鼠（Cre-BM）和Cre陽性野生型小鼠（Cre+ WT BM）的BM細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)。左panel展示Giemsa染色集落，右panel展示熒光顯微鏡下的集落圖像。77.6 ± 11.6表示yBM-DKO中的集落數(shù)量。
C.脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞3-4個(gè)月后，免疫功能低下小鼠發(fā)展出OS腫瘤。上panel展示H&E染色的腫瘤組織學(xué)驗(yàn)證，顯示了纖維母細(xì)胞/成骨細(xì)胞型OS。下panel展示發(fā)展的腫瘤免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色的Hoechst。
D.條形圖展示了在脛內(nèi)注射（IT）yBM、腫瘤和對照（Cre-BM）后，免疫功能低下小鼠發(fā)展成OS的百分比。
E.在NOD/SCID小鼠中，通過靜脈注射（IV）yBM細(xì)胞后，肺轉(zhuǎn)移的光鏡圖像、tdTomato免疫熒光圖像和H&E染色圖像。分別代表了肺轉(zhuǎn)移的可視化。
F.條形圖展示在靜脈注射yBM細(xì)胞后，NOD/SCOD小鼠發(fā)展成肺轉(zhuǎn)移的百分比（收集1.5月齡和6月齡小鼠）。
（4）導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期分子變化
圖5：導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期基因（yBM vs腫瘤細(xì)胞和yBM vs BMT細(xì)胞）。
A.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的主成分分析（PCA）。
B.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的維恩圖分析。yBM和腫瘤細(xì)胞之間的共有基因有303個(gè)。
C.yBM和腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析。
D.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的PCA圖。
E.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的Venn圖。yBM和BMT細(xì)胞之間的共有基因有471個(gè)。
F.yBM和BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析。
G.對照和yBM/腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
H.對照和yBM/BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
（5）WWOX丟失導(dǎo)致yBM細(xì)胞中的Myc改變
B.對照BM（NRM）、SKO和DKO的yBM細(xì)胞差異表達(dá)基因的熱圖（n=3)。
C.條形圖表示從對照BM、SKO和DKO-yBM細(xì)胞中的一些Myc靶基因的RNA-seq測序數(shù)據(jù)中的reads數(shù)。
D.DKO和SKO-yBM細(xì)胞中Myc靶基因的mRNA水平。
E.啟動(dòng)子區(qū)域最高M(jìn)yc富集的前50個(gè)基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖。
F.啟動(dòng)子區(qū)域Myc缺失的50個(gè)基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖。
G.SKO-yBM和DKO-yBM細(xì)胞的WWOX、c-Myc和p53的免疫印跡。P：親本細(xì)胞系，OE：過表達(dá)，PC：陽性對照，用nutlin（MDM2抑制劑）處理的HepG2細(xì)胞。展示了相對于SKO的WWOX和c-Myc蛋白水平的定量分析。
H.箱形圖表示來自TCGA TARGET GTEx的人骨肉瘤樣品中WWOX和Myc表達(dá)之間的相關(guān)性。高WWOX樣本>第75百分位，低WWOX<第25百分位，y軸代表Myc表達(dá)。PV：p值。
（6）DKO-yBM細(xì)胞中MCM7上調(diào)有助于其致瘤性
B.Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞中MCM7和c-Myc的免疫印跡（數(shù)字表示生物重復(fù)）。上圖顯示相對于Cre+WT BM細(xì)胞（對照）的MCM7蛋白水平的定量。下圖顯示SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）中MCM7和c-Myc蛋白水平的定量。
C.SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞的MTT增殖實(shí)驗(yàn)，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
D.SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）的克隆形成實(shí)驗(yàn) 圖表顯示了各組細(xì)胞存活率相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
E.SVA（µM）處理24小時(shí)后SKO和DKO-yBM細(xì)胞（每組兩個(gè)生物重復(fù)序列）的MTT增殖實(shí)驗(yàn)，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
F.在NOD/SCID小鼠中，通過脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞后，比較了對照組（未處理）和SVA（60 mg/kg）處理組腫瘤的平均大�。╟m3）和重量（g）。（*p<0.05，**p<0.01)。
G.對照組（vehicle）和SVA處理組腫瘤的H&E染色顯示OS成骨細(xì)胞/成纖維細(xì)胞特征，對照組和SVA處理的腫瘤的MCM7的IHC染色（左圖），與對照組相比（右圖），MCM7陽性染色的細(xì)胞核的定量（**p<0.001)。
研究結(jié)論
本研究強(qiáng)調(diào)了WWOX和p53作為腫瘤抑制基因在骨肉瘤（OS）發(fā)展中的重要性，Osx1陽性祖細(xì)胞中WWOX和p53的聯(lián)合缺失（雙敲除）導(dǎo)致了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和生長優(yōu)勢。這種優(yōu)勢至少部分由Myc過表達(dá)介導(dǎo)，可能發(fā)生在OS細(xì)胞增殖和存活的早期階段。僅p53敲除不足以驅(qū)動(dòng)觀察到早期分子變化，WWOX沉默和Myc過表達(dá)可能是預(yù)防和治療OS患者的的潛在靶點(diǎn)，為研究OS轉(zhuǎn)化、進(jìn)展和干預(yù)的分子機(jī)制提供了細(xì)胞和遺傳平臺。
參考文獻(xiàn)：
Akkawi R, Hidmi O, Yehya AH, Monin J, Diment J, Drier Y, Stein GS, Aqeilan RI. WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc. Cell Death Dis. 2024 Jan 5;15(1):13. pii: 10.1038/s41419-023-06378-8. doi: 10.1038/s41419-023-06378-8. PubMed PMID: 38182577.
2024年1月5日，以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rami I. Aqeilan團(tuán)隊(duì)在《cell death & disease》雜志發(fā)表題為“WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc”的研究論文。本研究通過構(gòu)建一個(gè)可追蹤的骨肉瘤小鼠模型，研究了WWOX基因在骨肉瘤發(fā)展中的作用，尤其是Myc基因及其靶基因MCM7的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明，BM MSC可能是骨肉瘤的起源細(xì)胞，且Myc和其靶基因可能是骨肉瘤發(fā)生的早期分子事件，這為骨肉瘤的早期診斷和治療提供了新的視角。
標(biāo)題：WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc（WWOX基因通過上調(diào)Myc促進(jìn)骨肉瘤發(fā)展）
時(shí)間：2024-1-5
期刊：cell death & disease
影響因子：IF 9
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
研究摘要
本研究構(gòu)建了一個(gè)可追蹤的骨肉瘤小鼠模型，該模型通過單敲除Trp53（SKO）或雙敲除Wwox/Trp53（DKO）并表達(dá)tdTomato報(bào)告基因。通過追蹤不同時(shí)間點(diǎn)的Tomato表達(dá)，研究者在非骨肉瘤攜帶小鼠骨髓（bone marrow）間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells ,MSC) （young BM，年輕BM）中檢測到早期的tdTomato陽性細(xì)胞。分析結(jié)果表明雙敲除年輕BM細(xì)胞（DKO yBM）在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出致瘤特性，這些雙敲除年輕BM細(xì)胞的分子和細(xì)胞表征揭示了其與骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的相似性。與單基因敲除年輕BM細(xì)胞相比，雙基因敲除年輕BM細(xì)胞中觀察到Myc及其靶基因上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組變化。Myc的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析揭示了Myc在雙敲除年輕BM細(xì)胞中對Myc靶基因的富集增加，而Myc靶基因在雙敲除的年輕BM細(xì)胞中上調(diào)。雙敲除年輕BM細(xì)胞中WWOX的恢復(fù)降低了Myc蛋白水平。相對于單敲除年輕BM細(xì)胞，MCM7（Myc的一個(gè)已知靶基因）在雙敲除年輕BM中上調(diào)。使用辛伐他�。╯imvastatin）抑制MCM7表達(dá)導(dǎo)致雙敲除young BM細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞生長減少。研究結(jié)果揭示了BM間充質(zhì)干細(xì)胞（BM MSCs）是研究骨肉瘤和Myc及其靶標(biāo)作為WWOX效應(yīng)器和骨肉瘤發(fā)生過程中早期分子事件。
研究結(jié)果
圖1：可追蹤的骨肉瘤細(xì)胞小鼠模型
B.Cre陰性（Cre-），Cre陽性（Cre+ WT）和雙敲除（DKo tom）小鼠的基因組PCR。左panel的標(biāo)簽表示引物對，右panel的標(biāo)簽表示預(yù)期的條帶大小。
C.從（1）Cre陰性小鼠，（2）Cre+ WT小鼠，（3）DKO TOM小鼠提取的骨骼熒光顯微鏡圖像。
D.來自Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠的冷凍骨切片的免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色hoechst。
E.2月齡（2m）的Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠BM細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。10.2±2.3表示與同齡Cre-小鼠相比，Cre+ WT和DKO BM中tdTomato陽性細(xì)胞百分比。
F.在Cre+ WT和DKO BM細(xì)胞中，免疫印跡分析對p53、WWOX、p21和tdTomato蛋白在未電離輻射暴露（0分鐘）及電離輻射暴露（IR-10Gy）（30分鐘和120 分鐘）的表達(dá)。（相對于Cre+ WT的定量印跡分析）。
WT：野生型，DKO：雙敲除，BF：bright field，RFP：紅色熒光蛋白（red fluorescent protein），BM：骨髓（bone marrow）。
（2）OS小鼠的骨髓（BM）細(xì)胞具有致瘤性
圖2：OS小鼠的BM細(xì)胞具有致瘤性并表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性。
A.從Cre−小鼠收集的BM（Cre-Direct BM）、從DKO TOM小鼠收集的腫瘤（Direct-tumor）和成對BM細(xì)胞（Direct-BMT）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，顯示tdTomato表達(dá)百分比（上panel，代表性實(shí)驗(yàn)。下panel，14只小鼠的tdTomato陽性細(xì)胞百分比的平均值）。B.與Cre+WT BM細(xì)胞相比，成對BMT和腫瘤細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)（代表性圖像左圖）（Giemsa染色和熒光顯微鏡圖像），Cre+BM、BMT和腫瘤細(xì)胞的集落數(shù)量的定量右圖（n=3）。
C.與對照上圖相比，NOD/SCID小鼠脛內(nèi)（IT）注射BMT和腫瘤細(xì)胞后發(fā)生的OS腫瘤的代表性圖像，H＆E驗(yàn)證OS中panel的組織學(xué)特征。組織學(xué)驗(yàn)證顯示為成骨細(xì)胞型OS，下panel為腫瘤發(fā)展的免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色hoechst。
D.條形圖表示IT注射對照BM細(xì)胞（對照）、BMT和腫瘤細(xì)胞后出現(xiàn)OS的免疫低下小鼠的百分比。
E.傷口愈合實(shí)驗(yàn)遷移。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度時(shí)間圖（n=3）。
F.創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度的時(shí)間圖（n=3）。
圖3：BMT與腫瘤細(xì)胞的分子相似性
A.腫瘤細(xì)胞（n=3）、成對BM細(xì)胞（BMT）（n=3） 和對照BM細(xì)胞（n=4）的主成分分析（PCA）圖 。B.腫瘤細(xì)胞（n=3）、成對BM細(xì)胞（BMT）（n=3）與對照組比較的Venn圖。BMT與腫瘤細(xì)胞之間的共有基因?yàn)?64。
C.熱圖顯示對照細(xì)胞和BMT/腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因。
D.通路富集分析。
E.對照組和BMT/腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
（3）young BM（yBM）細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤性
圖4：年輕BM（yBM）衍生細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤和轉(zhuǎn)移能力
A.不同年齡的基因編輯BM細(xì)胞（DKO-BM）和野生型BM細(xì)胞（Cre+ WT BM）中tdTomato陽性細(xì)胞百分比的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果（n = 3）。B.年輕非腫瘤攜帶小鼠（yBM-DKO）的BM細(xì)胞、Cre陰性小鼠（Cre-BM）和Cre陽性野生型小鼠（Cre+ WT BM）的BM細(xì)胞進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)。左panel展示Giemsa染色集落，右panel展示熒光顯微鏡下的集落圖像。77.6 ± 11.6表示yBM-DKO中的集落數(shù)量。
C.脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞3-4個(gè)月后，免疫功能低下小鼠發(fā)展出OS腫瘤。上panel展示H&E染色的腫瘤組織學(xué)驗(yàn)證，顯示了纖維母細(xì)胞/成骨細(xì)胞型OS。下panel展示發(fā)展的腫瘤免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色的Hoechst。
D.條形圖展示了在脛內(nèi)注射（IT）yBM、腫瘤和對照（Cre-BM）后，免疫功能低下小鼠發(fā)展成OS的百分比。
E.在NOD/SCID小鼠中，通過靜脈注射（IV）yBM細(xì)胞后，肺轉(zhuǎn)移的光鏡圖像、tdTomato免疫熒光圖像和H&E染色圖像。分別代表了肺轉(zhuǎn)移的可視化。
F.條形圖展示在靜脈注射yBM細(xì)胞后，NOD/SCOD小鼠發(fā)展成肺轉(zhuǎn)移的百分比（收集1.5月齡和6月齡小鼠）。
（4）導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期分子變化
圖5：導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期基因（yBM vs腫瘤細(xì)胞和yBM vs BMT細(xì)胞）。
B.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的維恩圖分析。yBM和腫瘤細(xì)胞之間的共有基因有303個(gè)。
C.yBM和腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析。
D.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的PCA圖。
E.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的Venn圖。yBM和BMT細(xì)胞之間的共有基因有471個(gè)。
F.yBM和BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析。
G.對照和yBM/腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
H.對照和yBM/BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。
（5）WWOX丟失導(dǎo)致yBM細(xì)胞中的Myc改變
圖6：WWOX表達(dá)與OS中的c-Myc呈負(fù)相關(guān)。
A.左panel顯示單敲除（SKO）和雙敲除（DKO）yBM細(xì)胞的Venn圖分析（n=3） ，其中308個(gè)基因是yBM DKO的特有基因。右panel的條形圖表示與SKO yBM相比，DKO特有的顯著通路（Myc靶標(biāo)）。B.對照BM（NRM）、SKO和DKO的yBM細(xì)胞差異表達(dá)基因的熱圖（n=3)。
C.條形圖表示從對照BM、SKO和DKO-yBM細(xì)胞中的一些Myc靶基因的RNA-seq測序數(shù)據(jù)中的reads數(shù)。
D.DKO和SKO-yBM細(xì)胞中Myc靶基因的mRNA水平。
E.啟動(dòng)子區(qū)域最高M(jìn)yc富集的前50個(gè)基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖。
F.啟動(dòng)子區(qū)域Myc缺失的50個(gè)基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖。
G.SKO-yBM和DKO-yBM細(xì)胞的WWOX、c-Myc和p53的免疫印跡。P：親本細(xì)胞系，OE：過表達(dá)，PC：陽性對照，用nutlin（MDM2抑制劑）處理的HepG2細(xì)胞。展示了相對于SKO的WWOX和c-Myc蛋白水平的定量分析。
H.箱形圖表示來自TCGA TARGET GTEx的人骨肉瘤樣品中WWOX和Myc表達(dá)之間的相關(guān)性。高WWOX樣本>第75百分位，低WWOX<第25百分位，y軸代表Myc表達(dá)。PV：p值。
（6）DKO-yBM細(xì)胞中MCM7上調(diào)有助于其致瘤性
圖7：MCM7上調(diào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
A.從1.5月齡、2.5月齡和4月齡的非腫瘤攜帶小鼠收集中的Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM中MCM7的mRNA水平（n = 3). ****p值 < 0.0001.B.Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞中MCM7和c-Myc的免疫印跡（數(shù)字表示生物重復(fù)）。上圖顯示相對于Cre+WT BM細(xì)胞（對照）的MCM7蛋白水平的定量。下圖顯示SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）中MCM7和c-Myc蛋白水平的定量。
C.SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞的MTT增殖實(shí)驗(yàn)，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
D.SVA（µM）處理24小時(shí)后Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）的克隆形成實(shí)驗(yàn) 圖表顯示了各組細(xì)胞存活率相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
E.SVA（µM）處理24小時(shí)后SKO和DKO-yBM細(xì)胞（每組兩個(gè)生物重復(fù)序列）的MTT增殖實(shí)驗(yàn)，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。
F.在NOD/SCID小鼠中，通過脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞后，比較了對照組（未處理）和SVA（60 mg/kg）處理組腫瘤的平均大�。╟m3）和重量（g）。（*p<0.05，**p<0.01)。
G.對照組（vehicle）和SVA處理組腫瘤的H&E染色顯示OS成骨細(xì)胞/成纖維細(xì)胞特征，對照組和SVA處理的腫瘤的MCM7的IHC染色（左圖），與對照組相比（右圖），MCM7陽性染色的細(xì)胞核的定量（**p<0.001)。
研究結(jié)論
本研究強(qiáng)調(diào)了WWOX和p53作為腫瘤抑制基因在骨肉瘤（OS）發(fā)展中的重要性，Osx1陽性祖細(xì)胞中WWOX和p53的聯(lián)合缺失（雙敲除）導(dǎo)致了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和生長優(yōu)勢。這種優(yōu)勢至少部分由Myc過表達(dá)介導(dǎo)，可能發(fā)生在OS細(xì)胞增殖和存活的早期階段。僅p53敲除不足以驅(qū)動(dòng)觀察到早期分子變化，WWOX沉默和Myc過表達(dá)可能是預(yù)防和治療OS患者的的潛在靶點(diǎn)，為研究OS轉(zhuǎn)化、進(jìn)展和干預(yù)的分子機(jī)制提供了細(xì)胞和遺傳平臺。
參考文獻(xiàn)：
Akkawi R, Hidmi O, Yehya AH, Monin J, Diment J, Drier Y, Stein GS, Aqeilan RI. WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc. Cell Death Dis. 2024 Jan 5;15(1):13. pii: 10.1038/s41419-023-06378-8. doi: 10.1038/s41419-023-06378-8. PubMed PMID: 38182577.
標(biāo)簽：
ChIP-seq
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