在近期的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)中，來(lái)自美國(guó)MImAbs的科學(xué)總監(jiān)François Romagné博士討論了針對(duì)困難靶點(diǎn)的抗體發(fā)現(xiàn)策略。他們使用mRNA免疫和Beacon單B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，加速獲得大量針對(duì)難以靶向的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和離子通道的具有分子功能多樣性的抗體。

 

從雜交瘤平臺(tái)到Beacon®單細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)

MImAbs是一個(gè)專注于發(fā)現(xiàn)和表征免疫治療抗體的研發(fā)平臺(tái)。MImAbs初期建立雜交瘤抗體平臺(tái)，其平均篩選通量為2000-3000個(gè)克隆，從免疫小鼠到純化得到leads抗體的時(shí)間需要4.5個(gè)月到5個(gè)月（圖1）。由于篩選的通量較低，得到最終可用于下游驗(yàn)證的抗體數(shù)和抗體多樣性可能不足，尤其是針對(duì)一些困難抗原的時(shí)候。

圖1. MImAbs基于雜交瘤的抗體發(fā)現(xiàn)流程

MImAbs在2022年初采購(gòu)Beacon®平臺(tái)，在過(guò)去的兩年中已經(jīng)開(kāi)展了20余個(gè)campaigns，對(duì)比發(fā)現(xiàn)Beacon®在普通靶點(diǎn)的抗體發(fā)現(xiàn)中具有更加快速高效的特征，篩選出的hits數(shù)目是雜交瘤的10倍以上（圖2）。在針對(duì)GPCR和離子通道等困難抗原的campaign當(dāng)中，Beacon®的單B細(xì)胞抗體發(fā)現(xiàn)流程更是展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。

圖2. MImAbs基于Beacon®的抗體發(fā)現(xiàn)流程

 

GPCR和離子通道抗體發(fā)現(xiàn)難點(diǎn)

GPCR（G Protein-Coupled Receptor），即G蛋白偶聯(lián)受體，是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，也是人類基因組編碼的最大蛋白家族，參與機(jī)體發(fā)育以及多種生理功能的調(diào)控，是重要的藥物靶點(diǎn)。GPCR的主體由7段跨細(xì)胞質(zhì)膜的α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，將信號(hào)由胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)。但是其N端的胞外區(qū)域只有40aa，其他的胞外的loop則更小。同為跨膜蛋白復(fù)合物的離子通道，是繼GPCR之后用于藥物發(fā)現(xiàn)的第二大類膜蛋白。離子通道胞外區(qū)不包含N-末端及C-末端，胞外區(qū)小且表位有限。這些特征讓這兩類蛋白缺乏足夠的免疫原性來(lái)在哺乳動(dòng)物宿主中產(chǎn)生強(qiáng)大的抗體反應(yīng)，而且難以表達(dá)重組蛋白用于傳統(tǒng)的高通量抗體篩選。

 

01

案例一：GPCR抗體發(fā)現(xiàn)

 

在最初針對(duì)GPCR的抗體發(fā)現(xiàn)，由于使用肽段的免疫效果不佳，無(wú)法檢測(cè)到抗體滴度，改用細(xì)胞免疫后雖檢測(cè)到抗體滴度，但在三個(gè)使用雜交瘤的campaign中都沒(méi)有成功篩選到抗體。研究者在改進(jìn)免疫方案，使用了全長(zhǎng)的mRNA進(jìn)行小鼠免疫，或mRNA聯(lián)合細(xì)胞進(jìn)行共同免疫，抗體滴度均得到有效提高（圖3）。
 

圖3. mRNA免疫策略得到更高抗體滴度

然而，在使用共計(jì)12只免疫小鼠進(jìn)行雜交瘤抗體發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，共計(jì)篩選了5229個(gè)雜交瘤克隆，只找到一個(gè)陽(yáng)性的克隆。而更早的超過(guò)10只細(xì)胞免疫小鼠的抗體發(fā)現(xiàn)則是一無(wú)所獲。

 

MImAbs使用同批次免疫的小鼠，利用Beacon®進(jìn)行漿B細(xì)胞抗體篩選，通過(guò)基于細(xì)胞表達(dá)GPCR進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)以篩選陽(yáng)性克隆。在Expt1（mRNA only）和Expt2 (mRNA+cells)中分別使用兩張11k芯片進(jìn)行抗體篩選，最終得到37個(gè)經(jīng)過(guò)體外驗(yàn)證為真陽(yáng)性的抗體分子（圖4）。

圖4. 雜交瘤和Beacon篩選GPCR抗體結(jié)果

被Beacon®篩選出來(lái)的陽(yáng)性hits的VH和VL序列顯示出多樣性（圖5），前期發(fā)現(xiàn)抗體的多樣性為后續(xù)的選擇和開(kāi)發(fā)提供了豐富的資源。

圖5. Beacon篩選出的抗體序列的多樣性

 

02

案例二：離子通道抗體發(fā)現(xiàn)

 

離子通道蛋白的campaign中只使用mRNA免疫并沒(méi)有可檢測(cè)到的抗體滴度。嘗試使用細(xì)胞免疫或者聯(lián)合mRNA進(jìn)行免疫，然而mRNA并沒(méi)有進(jìn)一步增加小鼠血清中的抗體滴度。細(xì)胞免疫在大多數(shù)的小鼠中只引起了接近于背景信號(hào)的免疫反應(yīng)。只有一只小鼠顯示出特異性的抗體滴度（#8），連同另外兩個(gè)低滴度的小鼠，被用于后續(xù)基于Beacon®的抗體發(fā)現(xiàn)（圖6）。

圖6. 離子通道的免疫策略和抗體滴度

在免疫效果更高的#8小鼠骨髓和脾臟漿B細(xì)胞中，Beacon®發(fā)現(xiàn)了30個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證為陽(yáng)性的hits。另外兩只滴度較低的小鼠內(nèi)，Beacon®也篩選到15個(gè)陽(yáng)性hits。其中30對(duì)VH-VH通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)該靶點(diǎn)的細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，12個(gè)VH-VL能夠結(jié)合表達(dá)了對(duì)應(yīng)離子通道的細(xì)胞（圖7）。后續(xù)的研究工作還在進(jìn)行當(dāng)中。

圖7. 離子通道hits的流式細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果

 

在研討會(huì)的最后，F(xiàn)rançois博士總結(jié)了Beacon®平臺(tái)在抗體發(fā)現(xiàn)中的優(yōu)勢(shì)：

 

✓增加篩選的深度和多樣性

● 在每個(gè)campaign中，雜交瘤只能篩選2000-3000個(gè)克隆。
● Beacon®每次可以篩選40,000個(gè)克�。�4張11k芯片）。

✓在單細(xì)胞層面針對(duì)重組抗原和轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行功能篩選

● 當(dāng)重組抗原可及的時(shí)候，雜交瘤能夠提供相對(duì)足夠的抗體多樣性。
● 單細(xì)胞FACS只能篩選可包被在微珠表面的可溶性抗原；應(yīng)用在記憶B細(xì)胞，相比于漿細(xì)胞分泌的抗體，膜表達(dá)IgG親和力更低。
● Beacon®篩選只測(cè)序經(jīng)過(guò)了幾層篩選的hits序列：抗原識(shí)別、初步的功能（如阻斷）或者交叉反應(yīng)。

✓縮短從hit鑒定到重組表達(dá)和驗(yàn)證的時(shí)間

● Beacon®單細(xì)胞操作節(jié)省了雜交瘤培養(yǎng)的時(shí)間。
● Hits回收（表達(dá)為重組mAbs）時(shí)無(wú)需基因合成。
● 基于Beacon®的流程在8周內(nèi)完成高達(dá)100個(gè)hits的小規(guī)模生產(chǎn)（數(shù)量可以通過(guò)增加自動(dòng)化進(jìn)一步提高）。