前言

微生物發(fā)酵是一種利用微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)來(lái)生產(chǎn)所需產(chǎn)品的技術(shù)。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，我們通常會(huì)對(duì)一些工藝參數(shù)，如pH、溫度、溶氧、攪拌速度等進(jìn)行在線(xiàn)檢測(cè)和控制。然而，判斷菌種生長(zhǎng)狀況的生化指標(biāo)如代謝產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等需要采用傳統(tǒng)的離線(xiàn)取樣方法。這種方法需要較長(zhǎng)的取樣周期和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室操作，可能帶來(lái)潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。
 

原位拉曼光譜技術(shù)作為一種有效的過(guò)程分析工具（PAT），能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)，如營(yíng)養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物、最終產(chǎn)品和細(xì)胞增長(zhǎng)。這種過(guò)程監(jiān)測(cè)技術(shù)提供的數(shù)據(jù)有助于優(yōu)化發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）的目標(biāo)，從而確保產(chǎn)品高品質(zhì)。

圖1 CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器 (1.5L)+原位拉曼光譜儀

迪必爾生物CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器采用了先進(jìn)的D²MS數(shù)據(jù)和設(shè)備管理系統(tǒng)，支持OPC和Snap7協(xié)議，實(shí)現(xiàn)了與市場(chǎng)上絕大多數(shù)的PAT設(shè)備的無(wú)縫對(duì)接，進(jìn)而監(jiān)控更為廣泛的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)。本次案例使用CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器整合ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀，完成大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中生化指標(biāo)的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)與反饋控制。

微生物發(fā)酵方案

在1.5L的CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器中進(jìn)行大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如表1所示。在整個(gè)培養(yǎng)周期中，每隔2h進(jìn)行離線(xiàn)取樣測(cè)量OD、碳源濃度（甘油）。同時(shí)，使用ReactRaman™ 原位拉曼光譜儀的探頭收集離線(xiàn)樣品的光譜，并上傳測(cè)量結(jié)果至配套的iC Raman分析軟件。軟件將各時(shí)間點(diǎn)的光譜與測(cè)量值一一對(duì)應(yīng)，并建立預(yù)測(cè)模型。將探頭插入反應(yīng)器中，作為在線(xiàn)PAT工具實(shí)時(shí)跟蹤OD和甘油濃度。


 

在線(xiàn)測(cè)量

甘油作為大腸桿菌碳源，其濃度會(huì)直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和代謝過(guò)程。由于滲透壓應(yīng)激和代謝應(yīng)激的存在，過(guò)高的甘油濃度可能會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用。因此，測(cè)量甘油濃度并確保其處于適宜的低水平范圍對(duì)于維持細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝活性是必要的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘油的離線(xiàn)數(shù)據(jù)與原位拉曼光譜儀的在線(xiàn)值之間的一致性(RMSE = 0.741g/L)。下圖表明，原位拉曼光譜儀作為在線(xiàn)PAT工具準(zhǔn)確地反映了生物反應(yīng)器內(nèi)的微生物培養(yǎng)條件。
 

圖3 使用原位拉曼光譜儀獲得的甘油濃度與離線(xiàn)測(cè)量對(duì)比圖

OD（光密度）測(cè)量是估計(jì)培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度的一種快速且簡(jiǎn)便的方法。OD值與培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，通過(guò)定期測(cè)量OD值，可以繪制出大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OD的離線(xiàn)數(shù)據(jù)與原位拉曼光譜儀的在線(xiàn)PAT值之間的一致性(RMSE = 4.926)
 

圖4 使用原位拉曼光譜儀獲得的OD與離線(xiàn)測(cè)量對(duì)比圖

反饋控制

如圖5所示，拉曼光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多個(gè)關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)的在線(xiàn)監(jiān)控。這一過(guò)程涉及將拉曼光譜數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸至生物反應(yīng)器，并與DCS等控制系統(tǒng)相結(jié)合。通過(guò)這種方式，可以利用控制系統(tǒng)的補(bǔ)料流加等模塊，對(duì)特定參數(shù)進(jìn)行在線(xiàn)反饋控制。如圖5、圖6所示，D²MS上位機(jī)軟件與拉曼光譜儀支持使用OPC UA 協(xié)議將數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)發(fā)送至控制系統(tǒng)。

圖5 基于D²MS系統(tǒng)的整合拉曼技術(shù)的自動(dòng)反饋控制
 

圖6 D²MS實(shí)時(shí)獲取原位拉曼光譜儀參數(shù)

比生長(zhǎng)速率是衡量單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的指標(biāo)。通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定OD值，能夠估計(jì)出細(xì)胞數(shù)量的變化，并據(jù)此計(jì)算比生長(zhǎng)速率，其常用公式為

𝜇=(ln(𝑂𝐷₂)−ln(𝑂𝐷₁))/Δt

·  μ 表示細(xì)菌的比生長(zhǎng)速率;

·  OD₂ 是在時(shí)間t₂的最終光密度讀數(shù);

·  OD₁ 是在時(shí)間t₁的初始光密度讀數(shù);

·  Δt 表示兩次測(cè)量之間的時(shí)間間隔，即t₂-t₁。

在本次反饋控制策略中，使用原位拉曼光譜儀測(cè)量，CloudReady™每5分鐘獲取一次OD平均值。然后，將當(dāng)前時(shí)間段內(nèi)的平均OD值和前一個(gè)時(shí)間段的平均OD值代入上述公式連續(xù)計(jì)算每個(gè)5分鐘時(shí)間段的比生長(zhǎng)速率。這些比生長(zhǎng)速率隨后被劃分為低（0.00167至0.005）、中（0.005至0.01）和高（0.01至0.01667）三個(gè)不同區(qū)間，并據(jù)此進(jìn)行分段反饋補(bǔ)料。不同區(qū)間的補(bǔ)料速率會(huì)根據(jù)各自的補(bǔ)料步長(zhǎng)和峰值限制進(jìn)行調(diào)整。此外，實(shí)時(shí)監(jiān)控甘油濃度，并將其與預(yù)設(shè)的閾值（1g/L）進(jìn)行比較，以此協(xié)同控制補(bǔ)料速率。補(bǔ)料速率的調(diào)整如圖7
 

圖7  使用原位拉曼光譜儀反饋補(bǔ)料的過(guò)程趨勢(shì)圖

結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)表明了利用強(qiáng)大的D²MS數(shù)據(jù)和設(shè)備管理系統(tǒng)將CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器與原位拉曼光譜儀進(jìn)行協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)多個(gè)關(guān)鍵分析物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并執(zhí)行反饋控制。生物反應(yīng)器加上PAT工具可以通過(guò)實(shí)時(shí)在線(xiàn)的連續(xù)數(shù)據(jù)來(lái)加速對(duì)工藝過(guò)程的理解，可以進(jìn)一步提升發(fā)酵過(guò)程工藝水平和自動(dòng)化程度，并最終實(shí)現(xiàn)基于QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

迪必爾生物 應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE）柴金言 許志國(guó) 供稿