在微生物研究，尤其是細(xì)菌學(xué)中，對(duì)菌體計(jì)數(shù)是一項(xiàng)最基本的需求。常規(guī)的計(jì)數(shù)方法主要是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的平板計(jì)數(shù)法和顯微鏡計(jì)數(shù)法，但它們耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大，且平板法只能計(jì)數(shù)活菌。

近年來，隨著熒光染料、結(jié)構(gòu)光學(xué)和流式細(xì)胞儀技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌等微生物成為可能。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，其具有靈敏、快速、高效、精確的優(yōu)勢(shì)，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為微生物研究中的一個(gè)重要工具，在單細(xì)胞層面對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能的多項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行更深層的分析，以研究細(xì)菌的異質(zhì)性和鑒定細(xì)菌種屬。

本方案以大腸桿菌為例，介紹層浪流式細(xì)胞儀如何評(píng)估活菌比例和計(jì)數(shù)。

——實(shí)驗(yàn)背景——
 

膜的完整性評(píng)估是細(xì)菌活力的重要評(píng)價(jià)手段，通常使用膜滲透性和非滲透性熒光染料來進(jìn)行活力測(cè)試，目前比較常見的染料是SYTO 9/PI。

SYTO 9 作為一種可滲透的綠色熒光核酸染料，被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，既可以進(jìn)入細(xì)胞膜完整的細(xì)菌中，也可以進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)菌中，與核酸染料結(jié)合。而紅色熒光核酸染料PI只能進(jìn)入不完整細(xì)胞膜的細(xì)菌中。當(dāng)SYTO 9和PI同時(shí)加的時(shí)候，PI染料進(jìn)入膜內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致SYTO 9熒光染料的降低。因此，具有完整細(xì)胞膜的細(xì)菌呈現(xiàn)綠色，而膜不完整的細(xì)菌呈現(xiàn)紅色。


圖1：SYTO 9/PI細(xì)菌活力測(cè)定法原理示意圖
 

——樣本處理——
 

1. 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，10000g，5min，離心洗滌，取細(xì)胞沉淀重懸于0.22um過濾的無(wú)菌PBS中；

2.進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，為后續(xù)染色做準(zhǔn)備；

3. 取4個(gè)流式管，標(biāo)記為空白組，SYTO 9和PI單染組，樣本組。每個(gè)試管加100ul細(xì)菌懸液，保證細(xì)菌數(shù)在10⁶-10⁷左右。

——樣本染色——
 

1. 根據(jù)廠家試劑盒建議，單染組分別加1ul SYTO 9或1ul PI，樣本組加1ul SYTO 9和1ul PI，加PBS至988ul。渦旋，室溫避光孵育15min；

2. 充分渦旋微球，每管分別加10ul，每份樣本中體系為1000ul；

3. 設(shè)置參數(shù)，用層浪FongCyte流式細(xì)胞儀采集信號(hào)，SYTO 9（Max Ex/Em=485/498nm）用FITC通道檢測(cè)，PI（Max Ex/Em=535/617nm）用PerCP通道檢測(cè)，兩個(gè)通道光譜重疊小，補(bǔ)償易調(diào)節(jié)。

——數(shù)據(jù)分析——

1. 細(xì)菌比較小，選擇對(duì)數(shù)模式分析。設(shè)置合適的電壓，使細(xì)菌群信號(hào)在流式圖中間清晰地呈現(xiàn)。設(shè)置合適的閾值，很大程度減少背景噪音。此實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置的是FSC和FITC雙閾值；

2. 根據(jù)FSC和SSC，圈出主細(xì)菌，右上角的一群是微球（圖2）；

3. 從主細(xì)菌中，選擇SYTO 9和PI，紅光區(qū)域的代表死菌，綠光區(qū)域的代表活菌（圖3）。
 

1. 原核生物平均直徑在1um左右，需要挑選合適的流式細(xì)胞儀。層浪的流式細(xì)胞儀檢測(cè)直徑在0.1-50um，除大腸桿菌外，還可以檢測(cè)葡萄球菌、酵母、浮游生物、益生菌等；

2. 層浪流式細(xì)胞儀可以獲得體積法絕對(duì)計(jì)數(shù)，跟微球法結(jié)果有較高的一致性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)；

3. 細(xì)菌活力染色實(shí)驗(yàn)對(duì)管路的潔凈度要求高，層浪流式細(xì)胞儀每管樣本間采樣針自動(dòng)清洗，攜帶污染率為0.05%，能夠獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

數(shù)據(jù)來源 : 廣州某實(shí)驗(yàn)室

層浪：  您好，可以采訪下您近期使用層浪流式細(xì)胞儀的感受嗎？

客戶：  可以的。

層浪：  在層浪的儀器上，您們?nèi)粘６甲瞿男�樣本�?/span>

客戶：  我們實(shí)驗(yàn)室開展多種流式實(shí)驗(yàn)，在微生物方面，除了細(xì)菌，還做酵母、益生菌檢測(cè)等。

層浪：  您對(duì)于層浪的儀器，有哪些使用感受和反饋嗎？

客戶：  我們之前用平板法培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，這種方式只能培養(yǎng)活菌，通常耗時(shí)3天左右，而流式細(xì)胞術(shù)對(duì)活菌和死菌都可以計(jì)數(shù)，比平板法的計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)高一些，更準(zhǔn)確一些，而且靈敏、檢測(cè)速度快、時(shí)間短，極大地提高了我們出數(shù)據(jù)的效率，我們現(xiàn)在逐漸用流式替代平板法了。

層浪：  確實(shí)，現(xiàn)在流式細(xì)胞儀在微生物研究中的作用越來越廣泛了。

客戶：  我們實(shí)驗(yàn)室之前有一款進(jìn)口的流式細(xì)胞儀，現(xiàn)在使用貴司的儀器，非常喜歡您們的軟件！中文的界面，功能鍵直觀，而且操作簡(jiǎn)單。細(xì)菌實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器的清潔度要求高，還要避免管路之間的交叉污染，之前我們是上完一個(gè)樣本，再上一管水，進(jìn)行反沖。而您們的儀器每個(gè)樣本之間能夠進(jìn)行采樣針清洗，免去了我們每管樣本手動(dòng)清洗的麻煩。做普通清洗和深度清洗也很方便，使用的清洗液用量也不大。

層浪：  非常感謝您的反饋。層浪會(huì)繼續(xù)努力，用心服務(wù)每一位客戶。


圖4：層浪生物FongCyte™3光14色流式細(xì)胞儀
 

參考文獻(xiàn)：

1、劉新星,霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn).流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用；微生物學(xué)通報(bào)。DOI:10.13344/j.microbiol.China.130041.

2、鄧穎,基于流式細(xì)胞術(shù)的SYTO 9/PI細(xì)菌活性判定方法優(yōu)化及其機(jī)理;暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文.

3、Philipp Stiefel, Sabrina Schmidt-Emrich,Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.DOI 10.1186/s12866-015-0376-x.

4、S M Stocks,Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight.doi: 10.1002/cyto.a.20069.

5、Martin G. Wilkinson,Flow cytometry as a potential method of measuring bacterial viability in probiotic products: A review.//doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.006.