馬鈴薯是全球消費量最大的非谷類糧食作物。大多數(shù)商業(yè)馬鈴薯品種是同源四倍體，具有高度雜合的基因組，嚴(yán)重阻礙了遺傳分析和改良。栽培馬鈴薯主要是無性繁殖，加上四倍體遺傳，傳統(tǒng)的馬鈴薯育種效率低下，與玉米和水稻等其他主要作物相比，這大大限制了馬鈴薯育種的進展，導(dǎo)致馬鈴薯市場多沿用數(shù)百年前的品種，缺乏多樣性和疾病抵抗力。自從單倍體馬鈴薯的第一個參考基因組(DM1-3 516 R44;(以下簡稱DM)于2011年發(fā)布后，越來越多的研究聚焦于各種野生和栽培二倍體馬鈴薯材料的基因組組裝，為馬鈴薯的基礎(chǔ)研究和育種提供了寶貴資源。然而解決馬鈴薯同源四倍體基因組中的四個單倍型仍然是一個挑戰(zhàn)。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所黃三文團隊，在2022年7月于植物領(lǐng)域國際權(quán)威刊物Molecular Plant上發(fā)表了題為“Genome architecture and tetrasomic inheritance of autotetraploid potato”的文章，重點報道了馬鈴薯的基因組結(jié)構(gòu)和四倍體遺傳研究。該研究團隊采用了從頭組裝策略，結(jié)合了PacBio高保真HiFi讀取初步組裝和遺傳圖譜輔助多倍體圖拼接，獲得了3.15Gb基因組組裝，N50長度為18.78Mb，并在48條染色體上錨定了3.03Gb的序列。這一高質(zhì)量的參考基因組為詳細(xì)研究自多倍體基因組的組成鋪平了道路。

據(jù)估計，馬鈴薯栽培品種C88的基因組大小約為3GB，將其離體苗的基因組DNA提取后，采用Sage Science 公司的多通道回收Sage ELF選擇性回收14-17kb片段，利用PacBio Sequel II測序平臺測序共生成了96.20 Gb的HiFi reads, N50長度為16.70 kb。對于Ultra-long Nanopore文庫，采用SageHLS HMW 超長片段回收儀進行分選，產(chǎn)生153 Gb的ONT讀段用于組裝，N50長度為66.3 kb。

繼而對C88植株的花、根、莖、幼葉和匍匐莖等組織分離總RNA，由Blue Pippin全自動DNA片段回收儀得到cDNA的大小，在PacBio Sequel II平臺上完成測序（測序數(shù)據(jù)附表1）。

附表1  C88測序數(shù)據(jù)：

 

利用先進的測序技術(shù)和多倍體圖譜分析方法相組合，成功實現(xiàn)了馬鈴薯C88一個染色體級別、單倍型解析基因組組裝。通過對四個單倍型的比較分析，揭示了四倍體基因組中廣泛的序列和表達(dá)差異。研究還發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯同源著絲粒的不同進化軌跡，并檢測到了不均勻分布在1034個自交后代中的雙重還原事件，是四倍體自交遺傳的特征。通過區(qū)分母系和父系單倍型集合，作者模擬了馬鈴薯四倍體雜交育種優(yōu)勢的起源，發(fā)現(xiàn)了3110個具有有害突變的四等位基因座，這些突變在雜合狀態(tài)下被兩個親本掩蓋。此項研究為了解自多倍體基因組的結(jié)構(gòu)提供了新的見解，并為馬鈴薯的育種提供了指導(dǎo)。

得益于測序技術(shù)的進步，已有一些四倍體馬鈴薯品種的染色體規(guī)模單倍型基因組組裝結(jié)果被釋放出來。越來越多可用的基因組為了解栽培馬鈴薯和其他自多倍體物種的生物學(xué)提供了重要的資源。

本文中討論的Otava基因組和C88基因組組裝，都用到了最新的HiFi測序技術(shù)。他們之間的差異在于組裝策略的不同。在Otava組裝中，相位化的reads被分成不同的組，并分別重新組裝。而在C88組裝中，相位信息輸入到組裝軟件hifiasm中，并應(yīng)用多倍體圖譜分組來指導(dǎo)整個基因組圖譜的組裝和生成新的contigs。C88基因組在連續(xù)性（以contig N50為指標(biāo)，18.78 Mb對比7.1 Mb）和完整性（以BUSCO分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，98.4%對比97.3%）方面優(yōu)于Otava組裝。這表明多倍體圖譜分組的策略在提高基因組連續(xù)性和完整性方面是有效的。因此，C88基因組和Otava基因組為自交多倍體基因組的單倍型解析組裝提供了有力的例證。

超長測序技術(shù)在馬鈴薯基因組研究中的應(yīng)用，主要通過獲得更長的DNA序列片段來改善基因組組裝的質(zhì)量。這種技術(shù)可以提供更準(zhǔn)確的序列信息，從而解決馬鈴薯基因組的連續(xù)性和完整性問題。通過超長測序技術(shù)，研究人員可以更好地解析馬鈴薯基因組中的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列，揭示其基因組的特點和演化過程。此外，超長測序技術(shù)還可以幫助研究人員分析馬鈴薯基因組中的遺傳變異和基因表達(dá)差異，進一步理解馬鈴薯的遺傳特性和基因調(diào)控機制。
 

10+kb：Nanopore常規(guī)測序文庫
型號：Blue Pippin 
Blue Pippin 全自動DNA片段回收儀程序中自帶的High Pass模式，即設(shè)定好回收的起點，系統(tǒng)可以自動回收起點以上的所有片段，干凈徹底的去除小片段DNA，有效提高Nanopore測序效率和質(zhì)量。

10-25kb：PacBio HiFi測序文庫
型號：Blue Pippin、Pippin HT、Sage ELF
PacBio HiFi測序?qū)�DNA文庫的長度均一性要求較高，最佳片段范圍為10-25kb。Sage Science產(chǎn)品中的Pippin HT高速高通量DNA片段回收儀、Blue Pippin全自動DNA片段回收儀 、Sage ELF多通道片段回收儀皆滿足該測序要求，而且Sage ELF還可將一樣本中不同長度的片段同時回收，最大限度利用樣本。

 

型號：HLS系列
Ultra-long DNA片段回收的一個重要應(yīng)用是在ONT三代測序，可以最大發(fā)揮ONT測序長度長的優(yōu)勢。Sage Science公司針對超大片段文庫的制備，推出了Sage HLS超大片段回收型號，最大可回收2Mb的DNA片段。下圖所示PromethION同Sage HLS聯(lián)用，N50最大可到143.3kb。

Sage HLS片段篩選后Nanopore測序，N50 高達(dá) 143.3 kb05
長片段DNA樣本質(zhì)控
 

Sage Science是全球領(lǐng)先的研發(fā)制造Pippin系列全自動核酸電泳片段回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國技術(shù)專利，各個型號產(chǎn)品可以高效完成不同長度范圍的DNA片段的精準(zhǔn)回收，廣泛用于二代測序、三代測序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。

環(huán)亞生物科技有限公司作為美國Sage Science公司在中國區(qū)的獨家代理商，自2011年以來將Sage Science的產(chǎn)品線引入國內(nèi)，一直為國內(nèi)用戶提供專業(yè)的全自動核酸片段回收系統(tǒng)的安裝測試、應(yīng)用培訓(xùn)，技術(shù)支持與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。環(huán)亞生物科技有限公司將一如既往的支持越來越多的Sage Science用戶。

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