自從1957年Marvin L minsky發(fā)明激光共聚焦掃描顯微鏡以來（LSCM），其出色的成像分辨率和信噪比，使得其在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究方面得到了廣泛應(yīng)用。目前，除了知名顯微鏡品牌推出了各種基于共聚焦原理的顯微鏡之外，也有很多研究人員為了提高圖像信噪比，根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)進(jìn)行共聚焦顯微鏡的搭建，從而進(jìn)行共聚焦成像。本期我們就來講講，想自己搭個(gè)共聚焦顯微鏡，該如何選擇探測器。

當(dāng)然在正式講解之前，也想與各位分享一下濱松自研的大幅降低共聚焦成像門檻的顯微成像模塊MAICO。

激光共聚焦顯微鏡具有出色的成像分辨率和信噪比主要是因?yàn)槭褂昧藛紊�激光作為光源。單色激光具有方向性比較強(qiáng)、發(fā)散角度小、亮度高的特點(diǎn)。由于激光光源波束的波長都是相同的，可以從根本上消除色差。同時(shí)，在光源和檢測器前面有一個(gè)針孔，其中光源針孔和檢測的針孔的位置相對于物鏡焦平面是共軛的，也是說經(jīng)過光源針孔的點(diǎn)光通過一系列的透鏡最終可同時(shí)聚焦于光源針孔和檢測針孔，也就是所謂的“共聚焦”。這樣的結(jié)構(gòu)可以將焦平面以外的雜散光擋住，消除了球差，進(jìn)一步提高了成像的質(zhì)量。并且點(diǎn)光源可以通過對樣品進(jìn)行左右、上下的掃描可以獲得厚標(biāo)本不同層面的圖像，可以對細(xì)胞或者組織厚片進(jìn)行類似CT斷層掃描的無損傷性連續(xù)光切片，然后利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行三維重建，能夠?qū)崿F(xiàn)從任意角度觀察標(biāo)本的三維剖面或者整體的結(jié)構(gòu)。

相關(guān)參數(shù)解析
在自己搭建的共聚焦測試系統(tǒng)中，選擇合適的探測器也是確保獲得高質(zhì)量圖像和精確信號的關(guān)鍵因素之一。一般會選擇光電倍增管（PMT）作為光信號探測器，在激光共聚焦顯微鏡探測器的選型中，需要注意以下幾點(diǎn)。

波長范圍

因?yàn)槭褂玫募す馄骱蜔晒馓结樀牟煌�，到達(dá)探測器端的波長信號也各有不同。光電倍增管具有較廣泛的波長檢測范圍，主要和陰極的材料有關(guān)，具有寬光譜的響應(yīng)特性，不同材料的波長覆蓋范圍可以參考下圖。所以在選型的時(shí)候，需要結(jié)合多個(gè)波段，選擇在這幾個(gè)波段下都有響應(yīng)的光電倍增管。

靈敏度

光電倍增管通常具有較高的靈敏度，能夠檢測低強(qiáng)度的光信號。但是在同一個(gè)陰極材料在不同波段下的靈敏度也各不相同。常見的光電倍增管的陰極材料為多堿材料，但目前也有量子效率比較高的磷砷化鎵（GaAsP）材料，如果需要觀測波長為近紅外光的熒光樣品，也有砷化鎵（GaAs）材料的光電倍增管型號。這幾種陰極材料在不同波段下的量子效率的對比如下。

所以在一些信號比較微弱的波長下，我們需要盡量選擇量子效率高的陰極材料制成的光電倍增管，可以提高成像質(zhì)量。

線性響應(yīng)

如果需要測量不同光強(qiáng)度水平的信號，那么選擇具有良好線性響應(yīng)的PMT非常重要。線性響應(yīng)是指PMT在不同光強(qiáng)度下輸出信號的比例保持恒定，如果選擇光電倍增管的線性輸出比較差，那可能在一些光比較強(qiáng)的環(huán)境下，出現(xiàn)線性偏離，影響成像的質(zhì)量。

響應(yīng)速度

在激光共聚焦顯微鏡中，一般是通過控制激光轉(zhuǎn)鏡來控制激光掃描范圍和掃描速度，掃描的速度越快，在單個(gè)點(diǎn)上停留的時(shí)間就比較少，那就需要光電倍增管能在短時(shí)間內(nèi)獲取該點(diǎn)的光強(qiáng)信息，需要有快的響應(yīng)速度，響應(yīng)速度越快，獲得的信息就越多，成像質(zhì)量就越好。

低噪聲

探測器的噪聲是影響圖像質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，低噪聲的探測器可以提高圖像的清晰度和信噪比。光電倍增管由于是真空電子管，在沒有任何光的時(shí)候，也會有信號輸出，我們把這一部分的信號稱之為暗噪聲，暗噪聲是不可避免的，所以只能是選擇暗噪聲比較低的光電倍增管來進(jìn)行信號探測。

動(dòng)態(tài)范圍

動(dòng)態(tài)范圍是指光電倍增管可以測量的最低和最高光強(qiáng)度之間的范圍。動(dòng)態(tài)范圍越高，獲取到的光強(qiáng)信息越全面，反映圖像的信息就越多，所以光電倍增管的動(dòng)態(tài)范圍也是制約圖像質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

除了以上的幾點(diǎn)，那還有其他的因素會影響我們探測器選擇，比如有效檢測面積、體積大小、裸管或者模塊等，所以在選擇時(shí)，我們需要結(jié)合多個(gè)因素進(jìn)行選擇。其中，光電倍增管模塊的產(chǎn)品相對來說使用比較簡單，對客戶的開發(fā)要求比較低，并且不太容易受到周圍環(huán)境的影響，是我們探測器選型的首選，那以下也介紹幾款常用在激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用中的光電倍增管模塊，用于平時(shí)的選型參考。

相關(guān)探測器推薦

以下是可以滿足不同客戶需求的探測器型號分享。

H10721系列

H9305系列

H16201系列

以上的這幾款都是電流輸出型的模塊，如果需要對信號采集，我們需要對信號進(jìn)行放大和轉(zhuǎn)換，基于此我們也有便于信號采集的電壓型輸出型模塊和放大器產(chǎn)品。電壓輸出型的模塊可以參考以下型號。

H10722系列（內(nèi)置放大器）

H10723系列（內(nèi)置放大器）

其中除了內(nèi)置的放大器，濱松也提供單獨(dú)的放大器產(chǎn)品，能夠覆蓋低通和高通頻率范圍。放大器的特性參數(shù)也會影響成像質(zhì)量，所以大家需要根據(jù)采集速率和采集卡的參數(shù)范圍選擇合適的放大器產(chǎn)品。

 

誠邀各位參與共聚焦成像活動(dòng)，添加工程師聯(lián)系方式。