葉黃素（Lutein）是人眼部視網(wǎng)膜黃斑部的主要色素。葉黃素對(duì)視網(wǎng)膜中的黃斑有重要的保護(hù)作用，是幫助眼睛健康發(fā)育的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素，人體無(wú)法通過(guò)自身合成，必須靠攝入葉黃素來(lái)補(bǔ)充。若眼睛缺乏葉黃素，會(huì)引起黃斑退化和視力模糊，甚至出現(xiàn)視力退化、近視、視網(wǎng)膜病變等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致失明。



目前，金盞花是商業(yè)葉黃素生產(chǎn)的主要來(lái)源。然而，種植成本高、生長(zhǎng)環(huán)境苛刻等因素在本質(zhì)上限制了天然葉黃素的進(jìn)一步開發(fā)利用。相比之下，微藻（microalgae）具有生長(zhǎng)快、葉黃素含量高、培養(yǎng)環(huán)境要求簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，被認(rèn)為是天然葉黃素最理想的來(lái)源。

 

小球藻(Chlorella sorokiniana)因其優(yōu)異的生產(chǎn)效率和對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)模式和廣泛培養(yǎng)條件的適應(yīng)性而成為一種有商業(yè)前景的葉黃素生物合成菌株。

 

近期，福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院副研究員謝友坪老師在影響因子為11.4的《Bioresource Technology》雜志中發(fā)表了最新的研究成果“High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency”。在此研究中，研究人員采用異養(yǎng)培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)了小球藻FZU60高效生產(chǎn)葉黃素，最后在5L生物反應(yīng)器（迪必爾生物）上做了放大培養(yǎng)。

結(jié)果顯示，通過(guò)在補(bǔ)料階段優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)物組分和濃度的方法，葉黃素的產(chǎn)量和生產(chǎn)速率最高達(dá)到了415.93 mg/L和82.50 mg/L/d。本研究提出了一種在藻類細(xì)胞中通過(guò)補(bǔ)料批次培養(yǎng)策略進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)的方式，可以顯著提高葉黃素的生產(chǎn)性能，具有很大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

 

研究路線

 

#1 小球藻FZU60在搖瓶中異養(yǎng)生長(zhǎng)性能的過(guò)程曲線
 

如圖1a所示，小球藻 FZU60在0-24 h期間處于適應(yīng)階段，生物量生產(chǎn)速率較低。在24-58 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，藻類生物量濃度(5.04 g/L)和生產(chǎn)力(2.04 g/L/d)在58 h達(dá)到峰值。在58 h之后，生物量濃度和生產(chǎn)速率均有下降，這可能是由于此時(shí)碳、氮源枯竭（圖1c），影響了細(xì)胞的C/N代謝，阻礙了藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)。

 

如圖1b所示，葉黃素含量隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在120 h時(shí)達(dá)到最高水平(4.09 mg/g)。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源和氮源幾乎耗盡，葉黃素仍然在持續(xù)合成，可以推斷，葉黃素的合成不需要培養(yǎng)液中可用的氮源和碳源。

圖1 小球藻 FZU60在搖瓶中異養(yǎng)性能的時(shí)間過(guò)程

(a) 生物量濃度和生產(chǎn)力

(b) 葉黃素含量和生產(chǎn)力

(c) 硝酸鹽和葡萄糖濃度

 

#2 初始細(xì)胞濃度(ICC)在搖瓶?jī)?nèi)對(duì)小球藻 FZU60異養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

圖2 初始細(xì)胞濃度對(duì)小球藻 FZU60異養(yǎng)葉黃素產(chǎn)量的影響

 

如圖2所示，隨著ICC的增加，小球藻FZU60的生物量生產(chǎn)速率先升高后降低，在ICC為1.40 g/L時(shí)達(dá)到最大值2.42 g/L/d，葉黃素含量從3.90 mg/g逐漸增加到4.79 mg/g，葉黃素最大生產(chǎn)速率達(dá)到最高，為10.71 mg/L/d。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加ICC有利于提高藻類細(xì)胞的異養(yǎng)生長(zhǎng)速率和葉黃素的生成。因此，確定異養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的最佳ICC為1.40 g/ L。

 

#3 培養(yǎng)溫度對(duì)小球藻 FZU60在搖瓶中異養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

 

從圖3可以看出，小球藻 FZU60的生物量生產(chǎn)速率、葉黃素的含量及葉黃素生產(chǎn)速率在培養(yǎng)溫度從20℃升高到30℃后顯著增加，在30℃時(shí)，小球藻的生物量、葉黃素含量和生產(chǎn)速率達(dá)到最高，然后隨著溫度進(jìn)一步升高到40℃均有下降，說(shuō)明小球藻FZU60異養(yǎng)生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)溫度為30℃。

圖3 溫度對(duì)小球藻 FZU60異養(yǎng)葉黃素產(chǎn)量的影響

 

#4 在5L發(fā)酵罐中提高葉黃素產(chǎn)量的基于營(yíng)養(yǎng)組分的補(bǔ)料分批策略

圖4 基于營(yíng)養(yǎng)成分的不同補(bǔ)料策略對(duì)小球藻FZU60發(fā)酵培養(yǎng)液的影響

(a) 生物量濃度和

(b) 葉黃素含量

 

為了進(jìn)一步提高小球藻 FZU60異養(yǎng)培養(yǎng)性能，研究了3種基于營(yíng)養(yǎng)成分組成的補(bǔ)料批次策略(補(bǔ)料批次GN：濃縮葡萄糖(500 g/L)和硝酸鹽(175 g/L)；補(bǔ)料批次MN：濃縮培養(yǎng)基以硝酸鹽為氮源；補(bǔ)料批次MU：濃縮培養(yǎng)基以尿素為氮源)。如圖4a所示，補(bǔ)料批次GN、MN和MU的最大生物量濃度分別為16.07、54.71和98.40 g/L。補(bǔ)料批次MU的生物量濃度顯著高于補(bǔ)料批次GN和MN。補(bǔ)料批次MU的生物量生產(chǎn)速率達(dá)到17.96 g/L/d，分別比補(bǔ)料批次GN和MN高231.98%和59.36%(表1)。
 

表1 基于營(yíng)養(yǎng)成分不同的補(bǔ)料策略下小球藻 FZU60異養(yǎng)性能比較

如圖4a所示，補(bǔ)料批次MN和MU的葉黃素含量從24 h到96 h逐漸增加，96 h后變化不大，而補(bǔ)料批次GN的葉黃素含量在24-72 h時(shí)約為2.30 mg/g，隨后急劇下降。最值得注意的是，補(bǔ)料批次MN的葉黃素含量始終超過(guò)補(bǔ)料批次GN和MU，且順序?yàn)檠a(bǔ)料MN >補(bǔ)料MU >補(bǔ)料GN。

 

然而，由于生物量濃度和生產(chǎn)力較高，補(bǔ)料批次MU的葉黃素產(chǎn)量和生產(chǎn)力分別達(dá)到289.20 mg/L和56.93 mg/L/d，高于補(bǔ)料批次GN和MN(表1)。綜上所述，補(bǔ)料批次MU是一種非常有效的提高小球藻FZU60異養(yǎng)生長(zhǎng)性能的補(bǔ)料策略。

 

#5 基于營(yíng)養(yǎng)濃度的5 L發(fā)酵罐高效生產(chǎn)葉黃素的批次補(bǔ)料策略

 

基于營(yíng)養(yǎng)成分不同的補(bǔ)料策略研究結(jié)果表明，與補(bǔ)料GN和MN相比，補(bǔ)料MU的葉黃素產(chǎn)量和生產(chǎn)力更高。接下來(lái)以尿素為氮源，研究了三種不同營(yíng)養(yǎng)濃度的培養(yǎng)基補(bǔ)料策略(補(bǔ)料批次1F：濃縮1倍；補(bǔ)料批次3F：濃縮3倍；補(bǔ)料批次6F：濃縮6倍)。
 

圖5 基于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度不同補(bǔ)料批次策略下小球藻 FZU60發(fā)酵培養(yǎng)液的影響。

(a) 補(bǔ)料批次1F

(b) 補(bǔ)料批次3F

(c) 補(bǔ)料批次6F

 

如圖5所示，補(bǔ)料批次3F的最高生物量濃度在144 h達(dá)到186.86 g/L，分別比補(bǔ)料批次1F和6F提高了102.76%和44.83%，且順序?yàn)檠a(bǔ)料3F >補(bǔ)料6>補(bǔ)料1F。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，補(bǔ)料批次1F的葉黃素含量從1.67 mg/g逐漸增加到4.09 mg/g。高于補(bǔ)料批次3F和6F策略的葉黃素含量，表明低濃度的營(yíng)養(yǎng)成分有利于葉黃素在藻類細(xì)胞中的積累。這可能是由于底物的周期性和頻繁限制引起的應(yīng)力效應(yīng)。然而，補(bǔ)料批次3F獲得了極高的生物量濃度（161.82 g/L）、生物量生產(chǎn)速率（32.10 g/L/d）、葉黃素產(chǎn)量(415.93 mg/L)和葉黃素生產(chǎn)速率(82.50 mg/L/d) (表2)，分別比1F/6F飼料批次高51.88%、63.17%、52.98%和63.79%。

 

表2 基于養(yǎng)分濃度的不同投料策略下小球藻 FZU60異養(yǎng)性能比較
參考文獻(xiàn)：Xie Y, Zhang Z, Ma R, et al. High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency. Bioresource Technology. 2022 Dec; 365:128130. doi: 10.1016/j.biortech.2022.128130.

 

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案例分享丨小球藻在T&J-Lux A攪拌式光照生物反應(yīng)器上的培養(yǎng)應(yīng)用

 

關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)備

文中提到的反應(yīng)器是來(lái)自迪必爾生物的Intelli-Ferm A/B/Q 系列臺(tái)式發(fā)酵罐（圖6、圖7）
 

圖6 Intelli-Ferm A 臺(tái)式發(fā)酵罐
 

圖7 Intelli-Ferm B 臺(tái)式發(fā)酵罐

 

該反應(yīng)器罐體（玻璃、一次性）體積覆蓋3L-15L，不僅滿足細(xì)菌、真菌的高密度培養(yǎng)，還可進(jìn)行小球藻（Chlorella soroiniana）、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、雨生紅球藻(Haematococcus Pluvialis)等微藻類植物細(xì)胞的高密度培養(yǎng)（圖6c）。

 

此外，為了滿足微藻類植物細(xì)胞的光自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)三種模式，迪必爾生物對(duì)該系列生物反應(yīng)器進(jìn)行升級(jí)，開發(fā)出了T&J-Lux A攪拌式光照生物反應(yīng)器（圖7）。
 

圖7 T&J-Lux A攪拌式光照生物反應(yīng)器

 

反應(yīng)器內(nèi)置紅、藍(lán)、綠三種不同顏色的光源，可實(shí)現(xiàn)最高50000Lux的光照強(qiáng)度。與硬件匹配的軟件系統(tǒng)整合了光亮等級(jí)分步設(shè)計(jì)，可進(jìn)行光亮參數(shù)梯度調(diào)節(jié)，同時(shí)可進(jìn)行光暗比的循環(huán)控制，滿足不同微藻類植物細(xì)胞對(duì)光色類別、光色比例、光照強(qiáng)度和光暗周期等工藝參數(shù)的調(diào)整。