Fig 1. 橫跨六個(gè)腦區(qū)的腦血管特征

2. AD患者細(xì)胞類型特異性腦血管改變
為了研究血管基因表達(dá)與AD之間的關(guān)系，基于單細(xì)胞的方法結(jié)合不同腦區(qū)域所有細(xì)胞類型的細(xì)胞，在AD患者和對照組之間鑒定了2676個(gè)AD DEGs（adDEGs）。通過排列分析，adDEGs的數(shù)量顯著高于的預(yù)期，并在pseudobulk水平得到證。其中，2142個(gè)僅為一種細(xì)胞類型所特有。值得注意的是，cEndo細(xì)胞具有最高數(shù)量的adDEGs，cEndo功能中轉(zhuǎn)錄差異的重要性與AD病理相關(guān)。

其中，細(xì)胞連接相關(guān)和粘附相關(guān)基因，包括APOD、PECAM1和COLEC12；包括SLC38A2、SLC2A1和SLC6A1在內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及與固醇輸入相關(guān)的基因，包括RORA、PRKAA2和PPARG，表明血管細(xì)胞類型的這些基本功能可能是AD 中可能存在失調(diào)。正如預(yù)期的那樣， AD樣本的PERs中PDGFRB的陽性率，暗示PERAD1,13中BBB完整性的損傷和功能障礙。ABCB1基因在cEndo細(xì)胞中明顯下調(diào)。細(xì)胞數(shù)量最多的三種細(xì)胞類型（cEndo，PER1和FIB1）顯示出最大的重疊。

對adDEGs進(jìn)行GO富集分析表明，多種廣泛的功能途徑在細(xì)胞類型之間是共享的，這表明AD中的轉(zhuǎn)錄變化在通路水平上富集到共同的功能；然而，許多途徑更具細(xì)胞類型特異性。

CD31+血管片段在個(gè)體AD中具有較高的INSR1轉(zhuǎn)錄密度。發(fā)現(xiàn)AD大腦中CD31+內(nèi)皮細(xì)胞的子集具有較高密度的INSR+。這些表明內(nèi)皮細(xì)胞的不同亞群可能表達(dá)不同水平的胰島素受體，使細(xì)胞對胰島素信號(hào)的敏感性增強(qiáng)或減弱。編碼高密度脂蛋白（HDL）成分的APOD在AD壁細(xì)胞中上調(diào)，這與以前報(bào)道的APOD在AD中的上調(diào)一致。為了驗(yàn)證AD PER中APOD的上調(diào)，使用原位雜交定量GRM8標(biāo)記細(xì)胞中的APOD轉(zhuǎn)錄豐度，并觀察到在患有AD的個(gè)體中GRM8+ PERs具有較高的APOD表達(dá)。PER中APOD上調(diào)的功能后果以及對神經(jīng)血管單元內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響將成為未來研究的基礎(chǔ)。此外，驗(yàn)證了SLC6A1在AD PER中的下調(diào)，以及COL4A1在AD的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的上調(diào)。
 

Fig 2. AD中細(xì)胞類型特異性腦血管改變

3. AD中DEGs的上游調(diào)控因子
鑒定了118個(gè)上調(diào)adDEG的上游調(diào)節(jié)因子和81個(gè)下調(diào)adDEG的上游調(diào)節(jié)因子，其中66個(gè)靶向各種細(xì)胞類型中上調(diào)和下調(diào)的adDEG。這133個(gè)調(diào)節(jié)因子中有17個(gè)是相應(yīng)的差異表達(dá)基因。當(dāng)這些調(diào)節(jié)因子顯示出目標(biāo)基因的顯著共享時(shí)，定義為共調(diào)節(jié)模塊（定義為tfModules）。對于cEndo中上調(diào)的adDEG，鑒定了7個(gè)tfModule，包括38個(gè)調(diào)節(jié)因子，以及11個(gè)不在tfModules中的調(diào)節(jié)因子。同一tfModule中的調(diào)節(jié)因子通常具有相關(guān)功能。 在每個(gè)tfModule中，調(diào)節(jié)因子具有各自靶基因數(shù)量、在AD中的差異表達(dá)以及靶基因的差異表達(dá)。并非每個(gè)tfModule中的所有調(diào)節(jié)因子都是DEG，這表明一些調(diào)節(jié)因子可能通過與差異表達(dá)的調(diào)節(jié)因子的協(xié)作發(fā)揮作用。

使用這些tfModules將目標(biāo)adDEG分為由不同tfModule組合介導(dǎo)的亞組。對于cEndo上調(diào)的adDEG，發(fā)現(xiàn)由單一tfModule靶向的群體和其他由多個(gè)tfModules靶向的群體，具有獨(dú)特的共同功能富集。相反，G1中的adDEG是由大多數(shù)tfModules（M1-M4、M6）的調(diào)節(jié)因子靶向的，并顯著富集在細(xì)胞因子反應(yīng)、細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中。幾個(gè)群體中的基因（G3、G7、G8）富集在抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)通路的表達(dá)上，這表明在AD中存在內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)，這與BBB破壞一致。
 

Fig 3. AD中DEGs的上游調(diào)控因子

4. AD細(xì)胞間通訊動(dòng)力學(xué)
通過分析跨越409個(gè)個(gè)體的基因模塊（定義為degModules）的協(xié)變分析，預(yù)測了細(xì)胞之間的雙向通信。發(fā)現(xiàn)了301個(gè)在AD中上調(diào)的相互作用，其中相互作用的degModules在AD中均顯示上調(diào)。來自PER1和cEndo細(xì)胞到神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的通信在AD中占主導(dǎo)地位，而來自星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元到cEndo細(xì)胞和FIB1s的通信在AD中主要減少。

為了表征這種差異細(xì)胞間通信的配體-受體信號(hào)通路，將由相同配體-受體對介導(dǎo)的單個(gè)相互作用聚集起來。TGFβ、SPP1、BMP、ANGPTL和IL-6介導(dǎo)的信號(hào)通路在AD增加的相互作用中顯著高表達(dá)，而膠原蛋白和層粘連蛋白是形成BBB基底膜的主要細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，其在AD減少的相互作用中高表達(dá)，這表明AD中BBB結(jié)構(gòu)被破壞。

排列測試發(fā)現(xiàn)大多數(shù)雙向細(xì)胞間相互作用的變化在AD中每種細(xì)胞類型對之間都是顯著的，這表明AD中失調(diào)的基因與多細(xì)胞相互作用高度相關(guān)。接下來，將每個(gè)細(xì)胞類型對之間的雙向AD差異細(xì)胞間相互作用分為正向和反向方向，并對它們進(jìn)行了量化。cEndo和PER1細(xì)胞以及興奮性神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用最多。為三個(gè)細(xì)胞-細(xì)胞對（cEndo-Ex、cEndo-Astro和PER1-Ex）構(gòu)建了配體-受體網(wǎng)絡(luò)，以突出特定的配體-受體信號(hào)通路。BMP6介導(dǎo)PERs（PER1）和興奮性神經(jīng)元（Ex）之間AD增加的相互作用，表明其在PER中控制神經(jīng)發(fā)生受損的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞和cEndo細(xì)胞之間由表皮生長因子（EGF）信號(hào)通路介導(dǎo)的AD減少的相互作用表明，在AD中抑制了cEndo的增殖。
 

Fig 4. AD全基因組關(guān)聯(lián)研究基因座與腦血管病相關(guān)

5. AD全基因組關(guān)聯(lián)研究基因座與腦血管病相關(guān)
將AD相關(guān)的位點(diǎn)與adDEG整合在一起，以預(yù)測其候選靶基因和作用方向，其作用的細(xì)胞類型以及它們可以直接或間接導(dǎo)致血管基因表達(dá)變化的機(jī)制。197個(gè)AD相關(guān)變異位于113個(gè)位點(diǎn)，它們接近125個(gè)血管adDEG，顯示出細(xì)胞類型特異性表達(dá)變化。大多數(shù)adDEG在其內(nèi)含子（54.3%）或緊鄰上游或下游且無介入基因（7.13%）中攜帶AD相關(guān)變異，或者根據(jù)不同證據(jù)相互關(guān)聯(lián)。這些AD相關(guān)的adDEG富集在多個(gè)過程中，包括膽固醇運(yùn)輸、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和IL-6介導(dǎo)的信號(hào)。21個(gè)GWAS位點(diǎn)與脂質(zhì)和膽固醇代謝adDEG基因相關(guān)聯(lián)，這與AD中廣泛失調(diào)的腦膽固醇穩(wěn)態(tài)是一致的。

9個(gè)AD GWAS位點(diǎn)與免疫反應(yīng)、胰島素分泌和神經(jīng)退行性病變有關(guān)，包括IL6和IL6R，它們在AD患者的cEndo細(xì)胞中高表達(dá)，提示內(nèi)皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)可能是AD血管的一個(gè)突出特征。
 

Fig 5. AD全基因組關(guān)聯(lián)研究基因座與腦血管病相關(guān)
 

尋找間接遺傳證據(jù)以證明血管adDEG的上游調(diào)節(jié)器直接與AD相關(guān)變異（轉(zhuǎn)錄調(diào)控）相關(guān)聯(lián)。使用了之前注釋的相關(guān)模塊對（degModules），并搜索了AD相關(guān)遺傳位點(diǎn)的adDEG配體，以尋找潛在的遺傳效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)了54對（24個(gè)上調(diào)和30個(gè)下調(diào)在AD中），其配體靠近AD相關(guān)遺傳位點(diǎn)，涉及611個(gè)與12個(gè)AD相關(guān)配體和13個(gè)受體（18個(gè)不同的配體-受體對）相關(guān)聯(lián)的血管adDEG。這12個(gè)AD相關(guān)配體代表了比預(yù)期更顯著的富集。其中7個(gè)配體顯示了單細(xì)胞表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（sc-eQTL）連接證據(jù)，3個(gè)顯示了組織水平腦eQTL證據(jù)，7個(gè)顯示了Hi-C環(huán)連接證據(jù)。其下游基因至少富集在17種不同的生物學(xué)功能中。總之，使用順式、轉(zhuǎn)錄或細(xì)胞間信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，AD中的2676個(gè)血管adDEG中有1010個(gè)可以與AD遺傳關(guān)聯(lián)。這表明遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素對腦血管的影響可能有助于AD的發(fā)病機(jī)制，這是通過腦血管細(xì)胞類型和大腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)、膠質(zhì)和巨噬細(xì)胞以及外周血中的免疫細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)功能障礙和細(xì)胞間通訊實(shí)現(xiàn)的。
 

Fig 6. AD GWAS基因與腦血管adDEGs間接相關(guān)

6. APOE基因型與血管細(xì)胞認(rèn)知功能下降
2482個(gè)apoeDEG在細(xì)胞類型中的分布大體均衡（平均而言，120個(gè)APOE4上調(diào)和120個(gè)APOE4下調(diào)），并且數(shù)量與adDEG相似。雖然只有中位數(shù)為4%的APOE差異基因與AD差異基因重疊，但apoeDEG與adDEG之間的重疊對于一些細(xì)胞類型來說具有重要意義。對于cEndo細(xì)胞，36%的apoeDEG上調(diào)基因也是adDEG上調(diào)基因，21%的apoeDEG下調(diào)基因也是adDEG下調(diào)基因。FIB1和PER1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)有力的apoeDEG-adDEG一致性（十倍至十四倍富集），而PER2和vEndo上調(diào)基因的一致性較弱（六倍至八倍）。

搜索了每個(gè)細(xì)胞類型中上調(diào)和下調(diào)的apoeDEG所富集的生物學(xué)途徑。在cEndo細(xì)胞中，下調(diào)的apoeDEG（E4-down）顯著富集在跨BBB運(yùn)輸、細(xì)胞連接組織以及調(diào)節(jié)芽生血管生成中。在PERs中，下調(diào)的apoeDEG富集在細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)、跨BBB運(yùn)輸以及細(xì)胞-細(xì)胞連接維持中，這與APOE ε4個(gè)體表現(xiàn)出腦血流量減少和腦血管異常增加的報(bào)道一致。評(píng)估了所有apoeDEG與認(rèn)知衰退的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的apoeDEG（E4-up）與所有細(xì)胞類型的認(rèn)知衰退相關(guān)，而下調(diào)的apoeDEG（E4-down）主要與認(rèn)知恢復(fù)相關(guān)。這種效果在cEndo、vEndo、FIB1和PER1細(xì)胞中最為明顯，E4-up和E4-down基因在認(rèn)知衰退相關(guān)性方面存在實(shí)質(zhì)性和高度顯著差異。結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，cPERs可能介導(dǎo)APOE4對認(rèn)知衰退的影響，并表明cEndo和FIB1細(xì)胞可能具有同等甚至更重要的作用。

進(jìn)一步鑒定了APOE基因型條件性的、與認(rèn)知衰退相關(guān)的差異表達(dá)基因（cogDEG），區(qū)分了‘認(rèn)知衰退上調(diào)’cogDEG和‘認(rèn)知衰退下調(diào)’cogDEG。前者與認(rèn)知衰退呈正相關(guān)，后者與認(rèn)知衰退呈負(fù)相關(guān)。APOE4個(gè)體比APOE3個(gè)體表現(xiàn)出更多的cogDEG（超過1.5倍），特別是在cEndo、vEndo、PER1和FIB1細(xì)胞中，尤其對于認(rèn)知衰退上調(diào)基因（2.1倍），這表明特定的腦血管細(xì)胞類型可能介導(dǎo)APOE ε4等位基因?qū)φJ(rèn)知衰退的貢獻(xiàn)。比較APOE3與APOE4 cogDEG，發(fā)現(xiàn)這兩組基因大部分不同，只有約5%的cogDEG在APOE4和APOE3之間是共同的，這表明ε3和ε4攜帶者在轉(zhuǎn)錄變化和認(rèn)知衰退的具體機(jī)制上存在差異。

為了進(jìn)一步研究APOE基因型條件性的cogDEG的功能，在毛細(xì)血管細(xì)胞類型（cEndo和PER1）中對E3特異性的、E4特異性的和E3-E4共享的cogDEG進(jìn)行了GO富集分析。對于cEndo認(rèn)知衰退上調(diào)的cogDEG，APOE4特異性富集包括脂質(zhì)和細(xì)胞因子反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡過程；APOE3富集包括血管運(yùn)輸、細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)節(jié)和細(xì)胞基質(zhì)粘附。對于cEndo認(rèn)知衰退下調(diào)的cogDEG，APOE4特異性富集包括血管發(fā)育、BMP信號(hào)的調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；APOE3富集包括內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織。對于PER1認(rèn)知衰退上調(diào)的cogDEG，APOE4特異性富集包括細(xì)胞因子反應(yīng)、細(xì)胞-細(xì)胞連接組裝和細(xì)胞凋亡；APOE3富集包括SMC遷移的負(fù)調(diào)節(jié)和Notch信號(hào)，以及自噬。對于PER1認(rèn)知衰退下調(diào)的cogDEG，APOE4特異性富集包括BBB相關(guān)功能（BBB維持、Notch信號(hào)、收縮調(diào)節(jié)），而APOE3富集包括脂質(zhì)和化學(xué)穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞連接組裝，這表明APOE ε4依賴的認(rèn)知衰退可能主要由PER1 PERs介導(dǎo)。
 

Fig 7. APOE4-相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化和認(rèn)知能力下降

參考文獻(xiàn)：
Sun N, Akay LA, Murdock MH, Park Y, Galiana-Melendez F, Bubnys A, Galani K, Mathys H, Jiang X, Ng AP, Bennett DA, Tsai LH, Kellis M. Single-nucleus multiregion transcriptomic analysis of brain vasculature in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2023 Jun;26(6):970-982. doi: 10.1038/s41593-023-01334-3. Epub 2023 Jun 1. Erratum in: Nat Neurosci. 2023 Oct 31;: PMID: 37264161; PMCID: PMC10464935.