MeRIP-seq等從m6A RNA甲基化角度揭示NFATc1對破骨細胞的調控機制
雙膦酸鹽類藥物是強效骨吸收抑制劑，是治療骨質疏松癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉移等疾病的首選藥物。這些藥物通過抑制甲羥戊酸通路和促進破骨細胞凋亡來促進骨吸收。雙膦酸鹽類藥物是治療骨質疏松癥和腫瘤相關骨病的標志性藥物。然而，在幾十年的臨床應用中，雙膦酸鹽類藥物已經引起了嚴重的副作用。
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，未來針對m6A甲基化的分子靶向治療將補充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團隊合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報告基因檢測、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調控機制。
標題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細胞誘導的骨吸收）
時間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報告基因實驗等
研究摘要：
骨質疏松癥對公眾健康有著深遠的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時抑制破骨細胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結果表明，以4249A為功能位點的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細胞骨吸收能力減少高度相關。METTL14上游通過甲基化功能位點NFATc1調控破骨細胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調m6A甲基化水平后對NFATc1的轉錄后調控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報告基因實驗、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調控機制。此外，外泌體上EphA2過表達是靶向遞送METTL14到破骨細胞的有效生物學方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細胞，幫助絕經后骨質疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質疏松的新型生物活性分子。
研究結果
（1）高通量測序和差異表達基因
經RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。
A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個差異表達和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對差異表達基因進行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達基因對感興趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關酶的差異表達。
J. m6A斑點印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測RAW264.7細胞中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細胞分化，并增加破骨細胞前體細胞的m6A甲基化水平
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對NFATc1轉錄后調控作用
ZOL刺激后，將NFATc1轉染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。將si-NFATc1轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預測NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調NFATc1的甲基化水平，從而對NFATc1的轉錄后調控表現(xiàn)出負相關
圖5：YTHDF1和YTHDF2對NFATc1轉錄后調控作用。
將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
ZOL刺激RAW264.7細胞后，根據(jù)不同分組分別轉染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調METTL14甲基化水平后對NFATc1轉錄后調控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對接受外泌體的破骨細胞的影響。
A-D．RIP實驗檢測不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測MC3T3-E1細胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉染至ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細胞外泌體進入RAW264.7細胞的免疫熒光圖像。用PKH26標記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結合作用。
M. METTL14轉染ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學變化。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對體內骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內的作用
將EphA2或METTL14轉染至MC3T3-E1細胞中，并按照不同的組分別或同時從細胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測骨組織形態(tài)學參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質動態(tài)組織形態(tài)學測量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個生物學重復，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細胞誘導的骨吸收之間存在強相關性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點。在先前的研究也報告了類似的結論。m6A修飾導致mRNA和lncRNA的局部結構發(fā)生變化，從而促進了異質核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結合。2577個m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結構重塑來調控RNA-蛋白質互作機制被稱為“m6A開關（m6A switch）”。m6A功能位點是相關生物學效應的核心。這個位于NFATc1 4249 A的“m6A開關”與破骨細胞分化和骨吸收密切相關。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調控“m6A開關”節(jié)點。兩個研究結果表明，與m6A甲基化相關的破骨細胞骨吸收由同一信號通路(NFκB)中不同的關鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細胞分化過程中起著關鍵作用，并且每個關鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點。這一理論基礎為通過m6A甲基化功能位點精確控制破骨細胞分化治療骨質疏松癥提供了新的思路。
參考文獻：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，未來針對m6A甲基化的分子靶向治療將補充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團隊合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報告基因檢測、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調控機制。
標題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細胞誘導的骨吸收）
時間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報告基因實驗等
研究摘要：
骨質疏松癥對公眾健康有著深遠的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時抑制破骨細胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結果表明，以4249A為功能位點的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細胞骨吸收能力減少高度相關。METTL14上游通過甲基化功能位點NFATc1調控破骨細胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調m6A甲基化水平后對NFATc1的轉錄后調控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報告基因實驗、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調控機制。此外，外泌體上EphA2過表達是靶向遞送METTL14到破骨細胞的有效生物學方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細胞，幫助絕經后骨質疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質疏松的新型生物活性分子。
本研究示意圖
ZOL導致NFATc1 m6A甲基化水平增加，其中4249bp A為功能位點，與破骨細胞骨吸收功能下降高度相關。上游，METTL14通過甲基化功能位點NFATc1調控破骨細胞骨吸收。下游，YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調m6A甲基化水平后對NFATc1的轉錄后調控表現(xiàn)出拮抗作用。研究結果
（1）高通量測序和差異表達基因
經RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。
圖1：高通量測序和差異表達基因
經RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個差異表達和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對差異表達基因進行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達基因對感興趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
圖2：ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
- 不同濃度的ZOL，成骨誘導21d或7d后對MC3T3-E1細胞和BMSCs進行茜素紅S（Alizarin Red S,ARS）或ALP（Alkaline phosphatase）染色。
- 不同濃度ZOL作用下MC3T3-E1細胞和BMSCs中ALP、Bglap、Col1α1和Runx2的相對表達水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測不同濃度ZOL作用下破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm。
- 不同濃度ZOL作用下TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核的直方圖。
- 不同濃度ZOL作用下RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- western blot檢測不同濃度ZOL作用下RAW264.7細胞中c-fos、NFATc1、RANK和NFκB p-P65蛋白的表達水平。
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關酶的差異表達。
J. m6A斑點印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測RAW264.7細胞中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細胞分化，并增加破骨細胞前體細胞的m6A甲基化水平
圖3：NFATc1–9片段對METT14調節(jié)破骨細胞分化過程的作用。
首先，將METTL14轉染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組trap陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- ZOL刺激后破骨細胞分化差異表達基因的熱圖。
- KEGG分析揭示了三個交集的差異表達基因：破骨細胞分化基因，MeRIP高表達基因和mRNA下調基因。
- RT-qPCR分析顯示ZOL刺激或METTL14過表達后10個差異表達基因的表達水平。
- NFATc1的基因組位點示意圖。
- 在ZOL刺激或未刺激下，NFATc1轉錄本中meRIP-Seq的m6A peaks可視化。m6A peaks位于NFATc1的3‘UTR區(qū)。
- SRAMP網站上NFATc1潛在的m6A甲基化位點。
- 根據(jù)潛在的m6A甲基化位點將NFATc1分為9個片段。
- m6A-RT-qPCR檢測ZOL刺激后抗m6A組和抗IgG組之間NFATc1的9個片段富集情況。
- m6A-RT-qPCR檢測NFATc1–9、10片段隨著ZOL濃度的增加而富集。
- m6A-RT-qPCR檢測ZOL或si-METTL14刺激下NFATc1–9、10片段的富集情況。
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對NFATc1轉錄后調控作用ZOL刺激后，將NFATc1轉染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。將si-NFATc1轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預測NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調NFATc1的甲基化水平，從而對NFATc1的轉錄后調控表現(xiàn)出負相關
圖5：YTHDF1和YTHDF2對NFATc1轉錄后調控作用。將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
ZOL刺激RAW264.7細胞后，根據(jù)不同分組分別轉染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時轉染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調METTL14甲基化水平后對NFATc1轉錄后調控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對接受外泌體的破骨細胞的影響。A-D．RIP實驗檢測不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測MC3T3-E1細胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉染至ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細胞外泌體進入RAW264.7細胞的免疫熒光圖像。用PKH26標記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結合作用。
M. METTL14轉染ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學變化。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對體內骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內的作用將EphA2或METTL14轉染至MC3T3-E1細胞中，并按照不同的組分別或同時從細胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測骨組織形態(tài)學參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質動態(tài)組織形態(tài)學測量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個生物學重復，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細胞誘導的骨吸收之間存在強相關性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點。在先前的研究也報告了類似的結論。m6A修飾導致mRNA和lncRNA的局部結構發(fā)生變化，從而促進了異質核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結合。2577個m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結構重塑來調控RNA-蛋白質互作機制被稱為“m6A開關（m6A switch）”。m6A功能位點是相關生物學效應的核心。這個位于NFATc1 4249 A的“m6A開關”與破骨細胞分化和骨吸收密切相關。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調控“m6A開關”節(jié)點。兩個研究結果表明，與m6A甲基化相關的破骨細胞骨吸收由同一信號通路(NFκB)中不同的關鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細胞分化過程中起著關鍵作用，并且每個關鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點。這一理論基礎為通過m6A甲基化功能位點精確控制破骨細胞分化治療骨質疏松癥提供了新的思路。
參考文獻：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
標簽：
RNA甲基化
