在制備病毒載體和疫苗的工藝方法中，基于微載體的貼壁灌流培養(yǎng)工藝是較為常用的技術(shù)路線。研發(fā)和生產(chǎn)過程中常用的微載體（以Cytodex Ⅰ為例）的投放濃度大多在3 ~ 10 g/L，而隨著微載體濃度的進(jìn)一步提高，會(huì)面臨微載體無法完全懸浮、細(xì)胞無法均勻貼壁等問題。

本文基于T&J CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器對超高微載體投放濃度（15 g/L）的參數(shù)條件進(jìn)行了挑戰(zhàn)性研究，完成Vero細(xì)胞貼壁效率及高密度灌流培養(yǎng)工藝驗(yàn)證。

方法與結(jié)果

攪拌槳葉冷模測試：在生物反應(yīng)器中加入與工作體積（200 mL）相等的PBS溶液和15 g/L Cytodex Ⅰ微載體，分別測試不同類型和數(shù)量的攪拌槳葉在不同轉(zhuǎn)速下微載體的懸浮情況（圖1），篩選合適的攪拌槳葉組合和安裝方式。
 

圖1  不同類型和數(shù)量的攪拌槳葉冷模測試

使用T&J CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器（圖2）進(jìn)行Vero細(xì)胞的培養(yǎng)。槳葉為雙斜葉槳，攪拌方向?yàn)橄聣菏�。灌流裝置安裝于生物反應(yīng)器內(nèi)部，通過管路與外部進(jìn)、出液瓶連接。實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置如表1所示，在完整的培養(yǎng)周期中，各參數(shù)控制均可靠且穩(wěn)定（圖3）
 

圖2  CloudReady™云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器

表1 工藝參數(shù)設(shè)置

圖3  培養(yǎng)過程中溫度、pH、DO參數(shù)控制穩(wěn)定性

接種后每2h取樣鏡檢情況，總計(jì)4次，如圖4所示，可見接種后6h細(xì)胞已在微載體表面鋪展開且貼附較均勻。

在整個(gè)培養(yǎng)周期中，微載體上細(xì)胞密度變化如圖5所示，葡萄糖和乳酸濃度變化如圖6所示。由每天取樣鏡檢圖像（圖7）可見，Day 1-2時(shí)細(xì)胞在微載體上貼附較為均勻，Day 3-5細(xì)胞快速增殖鋪滿微載體表面，空球率低，Day 6-8細(xì)胞在微載體上生長至較滿的狀態(tài)。

整個(gè)培養(yǎng)過程中灌流裝置未出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，細(xì)胞增殖17.6倍。
 

圖4 Day 0接種后每2h取樣鏡檢圖

圖5 微載體上細(xì)胞密度變化曲線
 

圖6 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線

圖7 每24 h取樣鏡檢圖

結(jié)論

本文基于T&J CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)平行生物反應(yīng)器對超高微載體投放濃度的參數(shù)條件進(jìn)行了挑戰(zhàn)性研究，將微載體投放量由先前的8 g/L(詳見Vero細(xì)胞高密度灌流培養(yǎng)及消化轉(zhuǎn)移工藝驗(yàn)證)提高至15 g/L，再次驗(yàn)證了高通量微小型生物反應(yīng)器在工藝開發(fā)與優(yōu)化方面應(yīng)用的優(yōu)勢和適配性。同時(shí)，也為微小型平行生物反應(yīng)器這類產(chǎn)品針對高密度貼壁細(xì)胞培養(yǎng)提供全新的解決方案，加速包括病毒性疫苗、間充質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞人造肉等眾多貼壁細(xì)胞領(lǐng)域的工藝開發(fā)進(jìn)程。
 

           迪必爾生物 應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE）張君軒 供稿