上周四，賽業(yè)生物細(xì)胞基因編輯生產(chǎn)經(jīng)理范麗莉「基因敲除細(xì)胞蛋白水平驗(yàn)證的挑戰(zhàn)和解決方案」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。
FAQ:
1.如何進(jìn)行基因敲除細(xì)胞株的驗(yàn)證以及單克隆的挑選？
2.構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系具體的實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)和原理及注意事項(xiàng)？
3.測(cè)序沒問題，但一直出現(xiàn)蛋白殘留的原因？
4.KO效率只用Tide測(cè)序結(jié)果證明就可以嗎？
5.RT-QPCR驗(yàn)證方法可靠嗎？
 

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Q. 如何進(jìn)行基因敲除細(xì)胞株的驗(yàn)證以及單克隆的挑選？
A. 基因敲除策略包括片段敲除和移碼敲除兩種策略，針對(duì)兩種策略驗(yàn)證方法不同。

片段敲除鑒定策略：
設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增三個(gè)區(qū)域，分別為兩個(gè)gRNA作用的區(qū)域（Region 1和Region 2）和敲除區(qū)域（Region 3），如圖1。如果gRNA作用的區(qū)域無法擴(kuò)增出條帶，而完整的敲除區(qū)域擴(kuò)增出比野生型小的條帶，則說明該細(xì)胞系在基因組水平上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了敲除。PCR后需進(jìn)行測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。
 

片段敲除細(xì)胞系的鑒定策略

移碼敲除鑒定策略：
設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增包含目的gRNA在內(nèi)的區(qū)域，一般300-500bp，如圖2。移碼sgRNA敲除通常會(huì)產(chǎn)生數(shù)量較少的堿基插入或缺失（indel），脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，所以無法鑒定是否產(chǎn)生indel。需要繼續(xù)對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，如果發(fā)生非3倍數(shù)的indel，則說明該細(xì)胞系在基因組水平上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了敲除。
 

圖2 移碼敲除細(xì)胞系的鑒定策略

關(guān)于單克隆挑選，大部分細(xì)胞可通過有限稀釋法將單細(xì)胞鋪在96孔板中，培養(yǎng)一段時(shí)間后顯微鏡下觀察單克隆形成情況，待單細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量再進(jìn)行單克隆挑選和鑒定。

Q. 構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系具體的實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)和原理及注意事項(xiàng)？
A. 基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建的原理：

基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了ZFN,TALEN到CRISPR三代技術(shù)革新，相比于ZFN和TALEN，CRISPR擁有簡單、價(jià)格低廉、易于編程且非常高效的優(yōu)點(diǎn)，CRISPR已被廣泛用于基因編輯。CRISPR制備基因敲除細(xì)胞系的原理如下：

Cas蛋白在sgRNA的帶領(lǐng)下，切開目標(biāo)基因組產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)，由于細(xì)胞無法在DNA被切斷的情況下存活很長時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，包括NHEJ和HRR通路，由DNA修復(fù)來達(dá)成DNA錯(cuò)配，從而造成基因的改變，基因敲除通過NHEJ通路修復(fù)產(chǎn)生。

基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)和注意事項(xiàng)：
1. 分子設(shè)計(jì)方面：
敲除策略選擇不當(dāng)
基因拷貝數(shù)多，gRNA切割不徹底
gRNA設(shè)計(jì)位置不當(dāng)，如未能覆蓋重要轉(zhuǎn)錄本
gRNA設(shè)計(jì)不當(dāng)，如效率低，脫靶率高等
致死性分析

解決方法：在分子設(shè)計(jì)方面結(jié)合賽業(yè)生物Smart CRISPR基因編輯系統(tǒng)和經(jīng)驗(yàn)豐富的生信分子團(tuán)隊(duì)進(jìn)行相應(yīng)的基因分析和設(shè)計(jì)，確保敲除成功。

2. 細(xì)胞方面：
遞送方式、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和單克隆制備困難

解決方法：遞送方式建議選擇RNP，效率高且低脫靶，摸索細(xì)胞培養(yǎng)條件，優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法和單克隆，確保敲除實(shí)驗(yàn)前獲取最優(yōu)條件。

3. 鑒定方面：
鑒定策略不合適，篩選不到陽性克隆
Western Blot抗體選擇不當(dāng)

解決方法：根據(jù)敲除策略選擇合適的鑒定方法，先在基因組水平上進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，需具備生信分析經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行陽性克隆判斷和篩選。使用賽業(yè)生物RDDC軟件進(jìn)行mRNA水平分析選擇產(chǎn)生移碼和提前終止的克隆。蛋白水平驗(yàn)證時(shí)需要選擇KO驗(yàn)證和文獻(xiàn)驗(yàn)證的抗體提升Western Blot成功率。

Q.測(cè)序沒問題，但一直出現(xiàn)蛋白殘留的原因？
A.可能的原因有：
1. Western Blot抗體的選擇不合適
2. 基因的可變剪切引起的蛋白殘留
3. 由于目的基因的多轉(zhuǎn)錄本引起的蛋白殘留
4. 目的蛋白本底表達(dá)低
5. 遺傳補(bǔ)償效應(yīng)：無義突變和同源序列

參考Western blot trouble shooting思路圖進(jìn)行原因排查

細(xì)胞和基因信息分析
1. 確保細(xì)胞和基因的準(zhǔn)確性。
2. 核對(duì)敲除策略和gRNA設(shè)計(jì)位置，確保gRNA設(shè)計(jì)在保守區(qū)域且盡可能覆蓋所有轉(zhuǎn)錄本。
3. 分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能會(huì)存在遺傳補(bǔ)償效應(yīng)。
4. 分析目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的本底表達(dá)水平，相應(yīng)調(diào)整Western blot參數(shù)。

DNA水平分析
1. 檢查鑒定策略是否合適，PCR電泳條帶與預(yù)期是否一致。
2. 核查測(cè)序原始數(shù)據(jù)，測(cè)序質(zhì)量是否合格，分析測(cè)序結(jié)果檢查是否還有未敲除干凈的序列，與野生型序列進(jìn)行比對(duì)確保敲除成功。

mRNA水平分析
兩種方法可以在mRNA水平進(jìn)行驗(yàn)證：
1. 使用賽業(yè)生物RDDC軟件對(duì)突變進(jìn)行可變剪切預(yù)測(cè)，如產(chǎn)生移碼和提前終止，則認(rèn)為mRNA水平敲除合格。
2.提取細(xì)胞mRNA進(jìn)行cDNA PCR和測(cè)序，并與野生型進(jìn)行比對(duì)，確定mRNA水平是否敲除成功。

蛋白水平分析
根據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果，使用相應(yīng)軟件將KO后的DNA翻譯成氨基酸序列，并與野生型氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定氨基酸水平是否發(fā)生敲除。

抗體分析
KO驗(yàn)證和文獻(xiàn)驗(yàn)證更優(yōu)，比對(duì)抗體免疫原位點(diǎn)與敲除區(qū)域位點(diǎn)，免疫原位點(diǎn)C端優(yōu)于N端，核對(duì)抗體是單克隆或者多克隆，單克隆優(yōu)于多克隆；抗體的品牌，進(jìn)口優(yōu)于國產(chǎn)。

Q. KO效率只用Tide測(cè)序結(jié)果證明就可以嗎？
A. Tide測(cè)序結(jié)果可以提過一個(gè)量化的KO效率，但不能只用Tide測(cè)序結(jié)果，我們?nèi)匀恍枰獙?duì)原始的測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，需要排除因測(cè)序質(zhì)量差等引起的假陽性結(jié)果。所以KO效率的判定需要依據(jù)測(cè)序原始數(shù)據(jù)和Tide分析2種方法綜合判定。

Q. RT-QPCR驗(yàn)證方法可靠嗎？
A. RT-QPCR檢查mRNA水平的敲除是可靠的。依照中心法則，DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到RNA分子，再由RNA翻譯生成蛋白質(zhì)。當(dāng)DNA水平進(jìn)行驗(yàn)證無問題后，DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄也可能會(huì)出問題，如形成可變剪切等情況，mRNA的驗(yàn)證也是有必要的。mRNA驗(yàn)證敲除成功后，那么理論上就無法翻譯生成正確的蛋白質(zhì)。