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小分子化合物的儲(chǔ)存及在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的使用指南

瀏覽次數(shù):659 發(fā)布日期:2023-11-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

  產(chǎn)品儲(chǔ)存
化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定產(chǎn)品:大多小分子較為穩(wěn)定,儲(chǔ)存條件為:固體狀態(tài):-20°C 3 年,4°C 2 年;儲(chǔ)備液狀態(tài):-80°C 半年,-20°C 1 個(gè)月,此外還存在以下幾種情況 (如下圖 1 所示)

圖 1不同小分子化合物的不同儲(chǔ)存條件
光敏感產(chǎn)品:進(jìn)行避光保存(可使用棕色瓶分裝或者錫箔紙包裹進(jìn)行避光);
易吸潮的產(chǎn)品:防潮處理(封口膜封口,如已經(jīng)溶解,不用擔(dān)心吸潮問題)
易氧化的產(chǎn)品:在惰性條件下儲(chǔ)存或者充氮保存(充氮保存)
以上三類產(chǎn)品,在做好儲(chǔ)存防護(hù)措施的情況下,儲(chǔ)備液 -80°C 半年,-20°C 1 個(gè)月。
光敏感且溶液不穩(wěn)定:這類產(chǎn)品基團(tuán)較為活躍,粉末狀態(tài)下避光儲(chǔ)存,溶解后建議盡快使用!如只是細(xì)胞實(shí)驗(yàn),建議購(gòu)買最小規(guī)格 
  小分子化合物的溶解和稀釋
在產(chǎn)品運(yùn)輸過程中,粉末或溶液可能會(huì)附著到管壁或管蓋上。在溶解前使用離心機(jī)低速離心,可減少產(chǎn)品的損失。
 

 
  溶劑選擇
萬能溶劑 DMSO : 一般建議其終濃度在 0.1% 以下,但是占比千分之一是非常保守的建議了,有些細(xì)胞本身并不敏感甚至可以承受 0.5%-1% 的 DMSO, 但是不管比例占比多大,均需要做好對(duì)照。
其他有機(jī)溶劑:DMSO 可用于大多化合物的溶解,但是不能盲目排斥其他有溶劑,例如 DMF 常用于順鉑,奧沙利鉑等鉑類產(chǎn)品的溶解(DMSO 會(huì)與鉑類產(chǎn)品的基團(tuán)形成絡(luò)合物,可能會(huì)影響活性);無水乙醇也是常見的有機(jī)溶劑,比如辛伐他汀(Simvastatin),需要先溶于無水乙醇、再用 NaOH 激活,再可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
不排斥“少見”溶劑:不要立馬拒絕看起來“奇怪”溶劑,比如番茄紅素,由于極大的疏水性,在 DMSO 無水乙醇中的溶解度都很低,但文獻(xiàn)中用常用四氫呋喃 (THF) 配置為 10 mM 的儲(chǔ)存液 。此外,丙酮(如下圖,丙酮對(duì)如下細(xì)胞系的影響與DMSO 相比更小)、乙腈、乙酸乙酯,這些溶劑雖不常見, 但也是溶解的好幫手。

圖 2丙酮作為溶劑對(duì)細(xì)胞活力的影響
水做溶劑:有些小分子類產(chǎn)品只能在水中溶解 (例如磷酸氯喹在水中(max)溶解度是,但是 DMSO 不溶解,但是等效游離形式只能在 DMSO 中溶解,水中不溶),用 DD 水配置儲(chǔ)存液之后,在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)稀釋到工作液之后,需要進(jìn)行過濾除菌(不建議過濾水溶的儲(chǔ)備液,儲(chǔ)備液過濾會(huì)有大的損耗)
  藥物溶解  
溶解度確定:首先確定好具體溶解度,如下產(chǎn)品,在 DMSO 中的(max)溶解度是 125 mg/mL ; 在無水乙醇中的(max)溶解度為 50 mg/mL(產(chǎn)品溶解度信息  說明書以及網(wǎng)頁 In Vitro 可見)

Need ultrasonic:指要達(dá)到(max)溶解度需要超聲輔助溶解 (建議使用超聲清洗儀器,使用頻次 20-40 kHz); 所需溶解度遠(yuǎn)低于(max)溶解度,吹打,渦旋輔助溶解即可。


圖 3不同的輔助溶解方式
進(jìn)行溶解:細(xì)胞實(shí)驗(yàn),如果選擇有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解,建議先配置(max)給藥濃度的 1000x 或者 500x 儲(chǔ)存液。
舉個(gè)栗子:購(gòu)買產(chǎn)品 Rapamycin (HY-10219) 5 mg , 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的(max)給藥濃度是 20 uM , 建議配置 1000x 或者 500x 的儲(chǔ)備液 (例如 5 mg 加入 273 μL 的 DMSO,為濃度為 20 mM 的儲(chǔ)備液)。在進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)候用培養(yǎng)基稀釋到具體給藥濃度(例如 1 mL 培養(yǎng)基里加入 1 μL 的 20 mM 的儲(chǔ)存液,則濃度為 20 μM)
圖 4使用摩爾計(jì)算器計(jì)算,配置儲(chǔ)備液
  部分較特殊的產(chǎn)品的溶解   
產(chǎn)品本身給藥濃度很高:多數(shù)產(chǎn)品在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用劑量都在 μM 級(jí)別,但是以 3-MA 為例, 該產(chǎn)品細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需濃度本身較高,在 1 -10 mM 之間,建議每次按照給藥濃度進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。
 
 

產(chǎn)品溶解后,儲(chǔ)存液不是澄清狀態(tài):細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前,一般情況下首先要確保產(chǎn)品在溶解后是澄清的狀態(tài),但是還會(huì)存在個(gè)別“漏網(wǎng)之魚”,例如 GW4869,經(jīng)實(shí)測(cè),建議先將產(chǎn)品用 DMSO 溶解為 10 mM 的儲(chǔ)備液 (呈現(xiàn)懸濁狀態(tài)),稀釋至工作液后,工作液呈現(xiàn)澄清狀態(tài)。

 
 

 
  溶劑選擇
易溶于水的產(chǎn)品:可依據(jù)實(shí)際的產(chǎn)品溶解度,使用 ddH2O 配置母液,PBS/saline 稀釋;或者直接用 PBS/saline 現(xiàn)用現(xiàn)配(此類產(chǎn)品,科研伙伴的心頭愛。

有機(jī)溶劑溶解:但產(chǎn)品無法水溶則需要用有機(jī)溶劑(下面以 DMSO 為例)先配置高濃度儲(chǔ)存液,再使用助溶劑進(jìn)行稀釋,正常小鼠則建議 給藥體系中有機(jī)溶劑占比不超過 10%(如 200 uL 里面 DMSO 占比不超過 20 μL), 可借助小工具進(jìn)行計(jì)算(輸入貨號(hào),給藥劑量/天數(shù)/動(dòng)物數(shù)量,著急的伙伴 28 秒入。

 
實(shí)用小工具-溶解度計(jì)算器 #MCE小課堂 @MCE抑制劑

小貼士:200 uL 給藥體系,DMSO 占比 10%:DMSO 在給藥體系里占有 20 uL,正常小鼠可耐受,但有免疫缺陷的小鼠,建議 DMSO 的占比盡量不超過 2% 。


圖 6. 不同類型的免疫缺陷鼠
現(xiàn)配現(xiàn)用的方案 
當(dāng)給藥 Buffer 疊滿:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中藥物使用的給藥劑量大 + 藥物在 DMSO 中溶解度低,不能首先儲(chǔ)備液配置再稀釋,則需要現(xiàn)配現(xiàn)用的方案,以下面產(chǎn)品為例 Cisplatin, 使用 0.5% CMC-Na 的溶液對(duì)藥物進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用:

首先用 50 mg CMC-Na 粉末定容在 10 mL 水中,形成 0.5% CMC-Na 的溶液,假設(shè)給藥濃度 10 mg/mL , 則直接稱取 10 mg 粉末溶于 1 mL 的 0.5% CMC-Na 溶液中,輔助超聲形成均勻懸濁液:


 
 Tips當(dāng)然除了上述 CMC-Na , PEG 300 這些的助溶劑,以下助溶劑也是實(shí)驗(yàn)的好幫手!
圖 7:常見助溶劑在不同的動(dòng)物給藥方式中的體積占比
 
 

1. Chen-Yu Lin, et al. The use of fetal bovine serum as delivery vehicle to improve the uptake and stability of lycopene in cell culture studies. Br J Nutr. 2007 Jul;98(1):226-32.
 
2. Leila Jamalzadeh, Hosein Ghafoori, et al. Cytotoxic Effects of Some Common Organic Solvents on MCF-7, RAW-264.7 and Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Avicenna J Med Biochem. 2016 June; 4(1):e33453.
 
3. Patricia V Turner, et al. Administration of Substances to Laboratory Animals: Routes of Administration and Factors to Consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011 Sep; 50(5): 600-13. 

 

 

來源:上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司
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