免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個(gè)基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。小優(yōu)已經(jīng)給大家詳細(xì)介紹了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之樣本制備》和《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之細(xì)胞分選》，今天我們繼續(xù)一起學(xué)習(xí)分型鑒定的相關(guān)內(nèi)容。

分型鑒定（Phenotyping）：利用細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行細(xì)胞鑒定，目前常用的方法是流式細(xì)胞術(shù)。

 

寫在前面：

如果我們利用流式分選得到目的細(xì)胞，一般來說，分選后需要回測細(xì)胞進(jìn)行目的細(xì)胞的純度驗(yàn)證，即分型鑒定，也就是說流式分選后目的細(xì)胞的分型鑒定與分選所用的細(xì)胞標(biāo)記物基本相同。

如果我們利用磁珠分選得到目的細(xì)胞，就意味著我們需要再設(shè)計(jì)一個(gè)流式實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分型鑒定。

下面，小優(yōu)給大家介紹通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫細(xì)胞分型鑒定需要確定的【六大方面】：

 

01 細(xì)胞數(shù)量

分選后的細(xì)胞懸液需要進(jìn)行計(jì)數(shù)，一般為5~10*106/ml，確保有足夠的細(xì)胞數(shù)量可以上機(jī)。

02 細(xì)胞表面標(biāo)記物

細(xì)胞表面標(biāo)記物的重要性不言而喻，細(xì)胞分選時(shí)也會(huì)涉及到，分型鑒定時(shí)我們也需要通過細(xì)胞表面標(biāo)記物來進(jìn)行圈門邏輯的設(shè)置。需要注意的是，分型鑒定后的細(xì)胞需要進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，不能選擇細(xì)胞的胞內(nèi)標(biāo)記物（胞內(nèi)檢測需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜處理，最后得到的就是死細(xì)胞了）。
 

比如磁珠分選小鼠脾臟Treg細(xì)胞后進(jìn)行流式分型鑒定的圈門邏輯如下：

 

圖1 流式鑒定小鼠脾臟Treg細(xì)胞圈門邏輯

 

03 熒光素標(biāo)記

流式分選和流式鑒定的配色原則是一致的，抗體偶聯(lián)熒光素的選擇原則，小優(yōu)在【細(xì)胞分選】中已經(jīng)給大家匯總啦，小伙伴們按需查看。

 

04 死活染料

如果分選后的細(xì)胞立即進(jìn)行分型鑒定，一般不用染死活，凍存細(xì)胞建議加入死活染料染色。

目前流式用死活染料分為兩大類：胺基類染料、核酸類染料。兩者的原理、使用階段、對(duì)應(yīng)的特定通道小優(yōu)也給大家做了匯總。由于核酸類死活染料可選產(chǎn)品少，占據(jù)了一些重要的熒光通道，小優(yōu)也建議大家優(yōu)先抗體配色后進(jìn)行核酸類死活染料的熒光搭配選擇。

 

圖2死活染料原理及對(duì)應(yīng)的特定通道

 

Tips：

①使用FVS等胺基類染料時(shí)，需要使用無疊氮鈉和無蛋白的DPBS溶液進(jìn)行洗滌和重懸細(xì)胞；

②染完FVS之后，需要使用含有蛋白（FBS、BSA）的染色液洗滌兩次，使游離的FVS染料失效，便于后續(xù)染色；

③核酸類染料的加入為所有操作的最后一步，臨上機(jī)前5-10 min加入即可，無需洗滌；

④核酸類染料與核酸空間共價(jià)結(jié)合，熒光弱，染色后，避免洗滌，劇烈渦旋或過度用力吹打，避免核酸類死活染料的脫落，導(dǎo)致假陰性；

⑤核酸類死活染料染色后，需及時(shí)上機(jī)（1h內(nèi)），避免染料的毒副作用導(dǎo)致額外的死細(xì)胞產(chǎn)生；

⑥核酸類死活染料4℃保存，不能凍存。

 

05 流式對(duì)照

流式對(duì)照對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功也是至關(guān)重要的，小優(yōu)在下表里也給大家列舉了一些對(duì)照的作用以及它們的應(yīng)用場景。

 

圖3 流式對(duì)照匯總

 

Tips：

Fc受體阻斷劑推薦使用，可減少抗原抗體的非特異性結(jié)合以及產(chǎn)生過強(qiáng)的背景信號(hào)，可使用：

①商業(yè)化Fc Block

②樣本種屬或流抗來源種屬的血清

③樣本種屬或流抗來源種屬的IgG

 

06 染色方案

染色方案也可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，主要是為了防止熒光選擇不當(dāng)，導(dǎo)致染色信號(hào)過強(qiáng)或過弱。需要考慮的因素包括但不限于抗體用量、染色體積、孵育時(shí)間、孵育溫度、洗滌次數(shù)等。

 

Tips：

①不同的檢測指標(biāo)、抗體品牌、熒光素標(biāo)記、抗體批次都會(huì)導(dǎo)致抗體的效價(jià)不同，要得到最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果，我們要對(duì)每一個(gè)抗體進(jìn)行抗體滴定實(shí)驗(yàn)以確定最佳的抗體用量；

②一般來說，染色體積不變，抗體用量不變（細(xì)胞數(shù)量10倍左右的浮動(dòng)范圍穩(wěn)定）；染色體積增加，必須增加抗體用量以保持抗體濃度穩(wěn)定；

③染色體積一般為50-100μl；

④抗體孵育時(shí)間與溫度：最常用的是4℃，30-60 min，可減少非特異性結(jié)合，熒光最穩(wěn)定不易淬滅；臨床檢測最常用室溫（20℃左右），15-30 min；

⑤細(xì)胞離心，推薦300g-500g，5 min，抗體的洗滌推薦直接使用流式管操作，1次洗液用量2ml；

⑥為了保證細(xì)胞的活力，染色后需盡快上機(jī)。

小優(yōu)也給大家針對(duì)上述內(nèi)容做了重點(diǎn)匯總：

圖4 利用流式進(jìn)行免疫細(xì)胞分型鑒定重點(diǎn)總結(jié)

 

寫在最后：

如果磁珠分選后的細(xì)胞我們不能立即進(jìn)行分型鑒定，那就涉及到細(xì)胞的保存以及活力測定。

短期保存：將分選得到的細(xì)胞用適量含10%-20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)基重懸至合適密度，置于4℃保存。

長期保存：液氮深低溫（-196℃）保存細(xì)胞，可加入10%二甲亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑。

活力測定：最簡便常用的方法為臺(tái)盼藍(lán)染色法。臺(tái)盼藍(lán)是一種陰離子型染料。這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色；死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，染料可通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，故死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。

做好細(xì)胞的保存、復(fù)蘇及復(fù)蘇后的活力測定，就可以按照上面的步驟再通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的分型鑒定了！
 

好啦，免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧之分型鑒定的內(nèi)容也給大家介紹完了，下一個(gè)擴(kuò)增&培養(yǎng)，我們不見不散呀！

 

資料來源：

圖片來源于優(yōu)寧維；視頻來源于嗶哩嗶哩半瓶流式小美膩