文章標(biāo)題：Transcriptome Analysis Revealed the Mechanism of Inhibition of Saprophytic Growth of Sparassis latifolia by Excessive Oxalic Acid
發(fā)表期刊：cells
影響因子：6.0
技術(shù)平臺(tái)：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，qRT-PCR

研究背景
廣葉繡球菌(Sparassis latifolia)是一種價(jià)值極高的食用菌，具有豐富的活性成分和藥理作用，是一種重要的藥用和食品資源。廣葉繡球菌是亞洲廣泛種植和消費(fèi)的商業(yè)蘑菇，但菌絲生長(zhǎng)速度慢嚴(yán)重制約了其栽培規(guī)模的擴(kuò)大。對(duì)底物的利用是直接了解菌絲生長(zhǎng)的關(guān)鍵，以往研究發(fā)現(xiàn)其菌絲在生長(zhǎng)過程中分泌大量草酸(Oxalic acid, OA)，草酸可以抑制菌絲生長(zhǎng)。然而，在腐生植物生長(zhǎng)過程中，對(duì)草酸生長(zhǎng)速率的機(jī)制尚未深入闡明。目前還沒有研究人員著重研究廣葉繡球菌腐生生長(zhǎng)緩慢的原因以及草酸對(duì)其菌絲生長(zhǎng)緩慢的抑制作用。本研究利用illumina測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了不同草酸濃度下廣葉繡球菌菌絲生長(zhǎng)速率的差異特性，為闡明腐生過程中菌絲生長(zhǎng)緩慢的機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

結(jié)果
1. 不同草酸濃度下廣葉繡球菌菌絲生長(zhǎng)的研究
在不同草酸濃度的松木木屑培養(yǎng)基(Pine sawdust medium, PSM)中培養(yǎng)20 d后的廣葉繡球菌菌絲表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)特征。在高草酸濃度(10 mM)條件下，廣葉繡球菌菌絲菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，菌絲生長(zhǎng)速率最低（圖1 A-C）。在PSM培養(yǎng)基中添加三氟碘甲烷(3,3-difluorooxaloacetate, IOA)，菌絲生長(zhǎng)速率顯著提高，生長(zhǎng)速率顯著高于其他處理（圖1 D）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，過量的草酸會(huì)抑制廣葉繡球菌菌絲的生長(zhǎng)，通過抑制草酸的合成降低草酸濃度進(jìn)而顯著促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

圖1. 草酸對(duì)PSM培養(yǎng)基中廣葉繡球菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

2. 差異基因篩選
本研究對(duì)兩兩間（對(duì)照組CK、草酸合成抑制組IOA和草酸添加組OA）的差異基因進(jìn)行篩選，OA組與CK組篩選出4478個(gè)差異基因（上調(diào)2248個(gè)、下調(diào)2030個(gè)）， IOA組與CK組篩選出1331個(gè)差異基因（上調(diào)666個(gè)、下調(diào)665個(gè)），OA組與IOA組篩選出3397個(gè)差異基因（上調(diào)2105個(gè)、下調(diào)1892個(gè))（圖2 A、C-E）。利用差異基因繪制Venn圖，篩選出3個(gè)比較組共同或特有的差異基因（圖2 B），發(fā)現(xiàn)與OA相關(guān)的比對(duì)組中篩選到的差異基因最多，而在OA組中，廣葉繡球菌菌絲的生長(zhǎng)速率最低，說明這些差異基因可能在菌絲生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用。綜上所述，這些結(jié)果表明草酸濃度影響了許多基因的表達(dá)，這些基因可能與菌絲生長(zhǎng)密切相關(guān)。
 

圖2. CK、IOA和OA處理的差異表達(dá)分析

3. 差異基因功能分析
對(duì)篩選到的基因進(jìn)行GO功能注釋。OA與CK的比較中，4478個(gè)差異基因中富集了231個(gè)GO條目，包括56個(gè)分子功能(Molecular Function, MF)， 136個(gè)生物過程(Biological Process, BP)和39個(gè)細(xì)胞成分(Cellular Component, CC) （圖3 A）。MF富集的主要條目有轉(zhuǎn)錄因子活性、電子轉(zhuǎn)移活性、泛素結(jié)合、醇脫氫酶(NAD+)活性等條目。BP富集的主要條目為有氧呼吸、細(xì)胞對(duì)熱的反應(yīng)、線粒體ATP合成耦合電子傳遞、質(zhì)子跨膜運(yùn)輸、三羧酸(TCA)循環(huán)等。CC富集的主要條目為膜的組成部分、線粒體內(nèi)膜、呼吸鏈復(fù)合體等條目。IOA與CK的比較中，1331個(gè)差異基因中富集了117個(gè)GO條目，包括47個(gè)MF, 55個(gè)BP和15個(gè)CC(圖3B)。OA與IOA比較中，從3397個(gè)差異基因中富集了200個(gè)GO條目，包括43個(gè)MF, 139個(gè)BP和18個(gè)CC（圖3 C）。

圖3. 3種處理菌絲中差異基因的GO富集結(jié)果

對(duì)OA與CK、IOA與CK、OA與IOA這些比較篩選到的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖4 A），發(fā)現(xiàn)受草酸濃度影響的差異基因富集的KEGG通路類別為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和有機(jī)系統(tǒng)類別（圖4 B-D）。同時(shí)展示3個(gè)比較組前30條富集的KEGG通路，在不同的對(duì)照組中，這些通路中含有受高濃度草酸影響的顯著下調(diào)的差異基因（圖5）。高草酸濃度對(duì)代謝類通路影響最大，特別是對(duì)氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、外源生物降解代謝、糖類生物合成代謝和能量代謝的影響比較大。此外，許多參與環(huán)境信息加工的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因也被廣泛抑制。因此，這些代謝途徑極有可能與廣葉繡球菌菌絲的生長(zhǎng)有關(guān)。本研究篩選到編碼木質(zhì)纖維素降解酶的差異基因，包括內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(mRNA_2483)、外切-葡聚糖酶(mRNA_8946)、外切-β-1,3-葡萄糖苷酶(mRNA_6544)等，與IOA組相比，CK和OA組這些編碼基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。
 

圖4. KEGG通路分類富集分析
 

圖5. 不同比較組中TOP30 KEGG通路結(jié)果

4. 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗(yàn)證
隨機(jī)選擇3個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào)的差異基因，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相對(duì)表達(dá)水平。由結(jié)果可看出3個(gè)比較中，qRT-PCR基因表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯著一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
 

圖6. qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)論
本研究報(bào)道了不同草酸濃度誘導(dǎo)的廣葉繡球菌轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。通過三組比較，共鑒定出9206個(gè)差異表達(dá)基因，其中4587個(gè)基因下調(diào)，5109個(gè)基因上調(diào)。對(duì)差異基因的功能分析發(fā)現(xiàn)，過量草酸使與碳水化合物利用途徑、能量代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成代謝、聚糖生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào)。此外，在過量草酸處理的菌絲體中，編碼木材降解酶的基因顯著下調(diào)。本研究結(jié)果為過量草酸抑制腐生植物生長(zhǎng)提供了一種推測(cè)機(jī)制，為進(jìn)一步研究廣葉繡球菌菌絲生長(zhǎng)奠定了基礎(chǔ)。