膿毒癥被定義為由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中膿毒癥引起的全身促炎反應(yīng)是導(dǎo)致器官衰竭和死亡的關(guān)鍵因素之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種腸道菌群參與膿毒癥疾病的發(fā)生和進(jìn)展。嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila, AKK) 被認(rèn)為是一種功能性益生菌菌株，對(duì)許多疾病的進(jìn)展具有保護(hù)作用；然而，AKK是否參與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

2023年8月，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陳鵬、姜勇團(tuán)隊(duì)、珠江醫(yī)院周宏偉團(tuán)隊(duì)及中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)段屹團(tuán)隊(duì)共同在《Gut》（IF=24.5）在線發(fā)表題為“Novel tripeptide RKH derived from Akkermansia muciniphila protects against lethal sepsis”的研究論文。此研究發(fā)現(xiàn)AKK菌能夠產(chǎn)生一種新型三肽RKH，可能作為一種新的內(nèi)源性TLR4拮抗劑，預(yù)防致死性膿毒癥。在成功地將其療效轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐后，RKH可能作為一種新的潛在治療方法來(lái)對(duì)抗致命性膿毒癥。該研究拓展了AKK的病理生理功能，為臨床治療致死性膿毒癥提供了一種新的潛在治療方法。
 

圖片來(lái)源：《Gut》

研究材料
小鼠：雄性C57BL/6小鼠，無(wú)菌（germ free）小鼠（賽業(yè)生物提供），TLR4^-/-小鼠；
豬：巴馬豬；細(xì)胞：小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDMs），THP-1細(xì)胞，病人外周血誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞等。

研究材料
測(cè)序技術(shù)：16S-rRNA測(cè)序，2b-RAD-M測(cè)序，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)；

常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：qRT-PCR，蛋白免疫印跡，組織HE染色，ELISA，血清損傷指標(biāo)檢測(cè)，流式細(xì)胞分選及分析技術(shù)，DNA凝膠電泳技術(shù)等；

其他技術(shù)：靶向定量技術(shù)，分子對(duì)接，表面等離子共振技術(shù)，酶解和熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)，免疫共沉淀等。

技術(shù)路線
01 AKK和膿毒癥關(guān)聯(lián)的研究：膿毒癥患者和膿毒癥小鼠的腸道AKK豐度均下降，提示AKK水平與膿毒癥相關(guān)，且僅依賴于活A(yù)KK
02 AKK改善膿毒癥的有效成分分析：活A(yù)KK產(chǎn)生新型三肽RKH參與膿毒癥預(yù)防，RKH處理可以預(yù)防膿毒癥小鼠致命性膿毒癥的發(fā)生
03 RKH預(yù)防膿毒癥機(jī)制的挖掘：RKH通過(guò)靶向結(jié)合TLR4并阻止TLR4激活，來(lái)預(yù)防膿毒癥引起的全身炎癥而發(fā)揮作用
04 RKH治療膿毒癥的臨床轉(zhuǎn)化探索：RKH降低膿毒癥巴馬豬模型死亡率、減輕全身炎癥和器官損傷，并負(fù)向調(diào)節(jié)膿毒癥患者來(lái)源巨噬細(xì)胞的促炎活性

研究結(jié)果
1.腸道AKK菌參與人類(lèi)和小鼠膿毒癥進(jìn)展
首先，研究人員對(duì)假手術(shù)和盲腸結(jié)扎穿刺法（CLP）構(gòu)建的膿毒癥小鼠的糞便進(jìn)行了2bRAD-M測(cè)序，以探索腸道微生物群與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展之間的潛在聯(lián)系。

在種水平上，與假手術(shù)組相比，CLP組的糞便中AKK豐度降低（圖1 A），隨后熒光定量PCR檢測(cè)中小鼠糞便中AKK的相對(duì)豐度也驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)（圖1 B）。重要的是，與小鼠模型一致，如圖1 C所示，61份膿毒癥患者糞便樣本的AKK豐度明顯低于27份對(duì)照樣本。為了闡明AKK在膿毒癥進(jìn)展中的作用，作者將高AKK和低AKK兩組人類(lèi)糞便移植到受體小鼠中并進(jìn)行CLP手術(shù)。有趣的是，接受高AKK豐度糞便的小鼠的存活時(shí)間往往略高于接受低AKK的小鼠（圖1 E），盡管其他細(xì)菌也可能參與膿毒癥的進(jìn)展，但這些數(shù)據(jù)表明，AKK細(xì)菌至少在一定程度上發(fā)揮了保護(hù)作用。因此，腸道AKK水平可能參與膿毒癥的進(jìn)展。

2.活A(yù)KK能夠保護(hù)致死性膿毒癥小鼠
接下來(lái)，為了確定AKK對(duì)膿毒癥的直接影響，作者用PBS、活A(yù)KK或死AKK處理小鼠，然后進(jìn)行假手術(shù)或CLP手術(shù)。圖1 F-H提示，活A(yù)KK，而不是滅活A(yù)KK可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。上述數(shù)據(jù)表明，AKK的保護(hù)作用可能取決于活細(xì)菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)。然后，作者評(píng)估了來(lái)自活A(yù)KK的培養(yǎng)上清液是否能緩解膿毒癥。圖1 I-K提示，與對(duì)照相比，自活A(yù)KK的培養(yǎng)上清液可以減輕膿毒癥引起的器官損傷和致死性。LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中的數(shù)據(jù)同樣驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)（圖1 L-O）。總之，這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，活的AKK可能通過(guò)產(chǎn)生保護(hù)性物質(zhì)，在小鼠模型中有效地挽救了致命性膿毒癥。
 

圖1 腸道AKK在小鼠模型中對(duì)致命性膿毒癥具有保護(hù)作用^[1]

3.活A(yù)KK產(chǎn)生新型的三肽Arg-Lys-His（RKH）
為了進(jìn)一步探索活A(yù)KK分泌的保護(hù)性物質(zhì)，作者對(duì)空白培養(yǎng)基和活A(yù)KK培養(yǎng)基的培養(yǎng)上清液進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)一種新的三肽RKH在活的AKK上清液中顯著富集，并在非靶向代謝組學(xué)分析中表現(xiàn)出最大的倍數(shù)變化（圖2 C-D）。靶向驗(yàn)證揭示RKH在活A(yù)KK培養(yǎng)基顯著高表達(dá)（圖2 E），且在膿毒癥病人中RKH含量顯著下降（圖2 H）。

重要的是，作者引入賽業(yè)生物提供的無(wú)菌（germ free）小鼠并對(duì)其進(jìn)行AKK菌定植，發(fā)現(xiàn)AKK菌定植組小鼠中血漿和盲腸內(nèi)容物RKH含量顯著回升（圖2 F-G）。為了探索RKH對(duì)致命性膿毒癥的潛在治療作用，在CLP手術(shù)前/ LPS注射前給小鼠服用RKH，結(jié)果提示（圖2 I-O），AKK活性產(chǎn)物RKH可以在小鼠模型中預(yù)防致命性膿毒癥。
 

圖2 活A(yù)KK產(chǎn)生的Arg-Lys-His（RKH）對(duì)小鼠致命性膿毒癥的保護(hù)作用^[1]

4.RKH預(yù)防膿毒癥引起的系統(tǒng)性炎癥
就細(xì)胞因子風(fēng)暴而言，系統(tǒng)性炎癥是膿毒癥發(fā)病期間死亡的主要因素之一。作者對(duì)Sham對(duì)照組，CLP組以及CLP+RKH處理組的小鼠腹腔灌洗液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果顯示RKH處理后，與CLP組相比其中全基因表達(dá)發(fā)生改變，且其中的炎癥因子表現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖3 A-B）。進(jìn)一步的，研究人員發(fā)現(xiàn)活A(yù)KK，AKK培養(yǎng)上清以及RKH處理能夠明顯降低系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)以及腹腔巨噬細(xì)胞富集（圖3 C-G）。此外，細(xì)胞體外刺激的結(jié)果顯示RKH能夠降低LPS誘導(dǎo)的多種巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)。綜上，RKH可能通過(guò)抑制膿毒癥引起的系統(tǒng)性炎癥發(fā)揮保護(hù)作用。
 

圖3 RKH預(yù)防膿毒癥引起的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)^[1]

5.RKH直接靶向TLR4并阻斷TLR4激活
TLRs在膿毒癥進(jìn)展過(guò)程中對(duì)入侵病原體的系統(tǒng)反應(yīng)起著重要作用。圖4 A-B提示，RKH能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞中TLR4下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者使用FITC熒光素標(biāo)記的LPS處理巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RKH能夠顯著抑制LPS的結(jié)合（圖4 C）。結(jié)合上述結(jié)果，作者猜測(cè)RKH能夠與LPS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TLR4，并通過(guò)表面等離子共振技術(shù)（圖4 D），酶解實(shí)驗(yàn)（圖4 E），熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)（圖4 F）和分子對(duì)接技術(shù)（圖4 I）驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。

更重要的是，免疫沉淀（IP）實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，RKH是通過(guò)抑制TLR4-MD2和TLR4-TLR4的二聚化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)TLR4下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制（圖4  G-H）。此外，根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果提示的RKH結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TLR4上的ARG264、LEU293、ASP294和LYS362可能是RKH抑制TLR4二聚的潛在功能結(jié)合位點(diǎn)。最后，作者引入TLR4^-/-小鼠對(duì)上述觀點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。小鼠進(jìn)行CLP手術(shù)后，RKH對(duì)生存率，臟器損傷和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)沒(méi)有保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，RKH對(duì)致命性膿毒癥的保護(hù)作用，至少部分是通過(guò)抑制TLR4信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)生的。
 

圖4 RKH直接靶向TLR4并阻斷TLR4激活^[1]

6.RKH延長(zhǎng)膿毒癥巴馬豬模型的存活時(shí)間并減少過(guò)度炎癥和器官損傷
為了進(jìn)一步擴(kuò)大RKH在臨床上治療膿毒癥的潛力，作者采用了巴馬豬膿毒癥大動(dòng)物模型。圖5提示，在巴馬豬膿毒癥模型中，RKH處理能夠顯著延長(zhǎng)生存率，降低血清中多種損傷指標(biāo)，緩解多臟器損傷以及減弱炎癥反應(yīng)。
 

圖5 RKH延長(zhǎng)膿毒癥巴馬豬模型的存活時(shí)間并減少過(guò)度炎癥和器官損傷^[1]

7.RKH負(fù)調(diào)控膿毒癥患者巨噬細(xì)胞的促炎活性
最后，為了進(jìn)一步評(píng)估RKH對(duì)人類(lèi)免疫細(xì)胞促炎活性調(diào)節(jié)的效力，從膿毒癥患者中提取外周血單核細(xì)胞，并在體外分化為巨噬細(xì)胞。圖6 A提示，RKH能夠顯著降低巨噬細(xì)胞IL-6的mRNA水平。此外，RKH不影響膿毒癥患者淋巴細(xì)胞正常功能（包括凋亡和細(xì)胞因子產(chǎn)生）。
 

圖6 RKH負(fù)調(diào)控膿毒癥患者巨噬細(xì)胞的促炎活性^[1]

研究結(jié)論
綜上所述，該研究提供了膿毒癥發(fā)展背景下宿主-微生物群落的相互作用的新證據(jù)。作者通過(guò)揭示活A(yù)KK產(chǎn)生的一種新的生物活性三肽RKH，擴(kuò)展了活A(yù)KK的病理生理作用。如果在未來(lái)的臨床實(shí)踐中對(duì)膿毒癥能夠發(fā)揮保護(hù)作用，尤其是對(duì)處于高炎癥狀態(tài)的患者，RKH可能是致命性膿毒癥的潛在有效治療方法。

原文檢索：
[1]Xie S, Li J, Lyu F, Xiong Q, Gu P, Chen Y, Chen M, Bao J, Zhang X, Wei R, Deng Y, Wang H, Zeng Z, Chen Z, Deng Y, Lian Z, Zhao J, Gong W, Chen Y, Liu KX, Duan Y, Jiang Y, Zhou HW, Chen P. Novel tripeptide RKH derived from Akkermansia muciniphila protects against lethal sepsis. Gut. 2023 Aug 8:gutjnl-2023-329996. doi: 10.1136/gutjnl-2023-329996. Epub ahead of print. PMID: 37553229.