背景知識(shí)：

HLS-CATCH技術(shù)是利用HLS（來(lái)自Sage Science公司的超長(zhǎng)核酸片段回收儀）聯(lián)合CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，獲取長(zhǎng)片段完整基因，長(zhǎng)度范圍50kb-400kb。其原理如圖1：（1）在HLS上直接裂解細(xì)胞，完整的基因組DNA釋放；（2）使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)靶向剪切獲取目標(biāo)長(zhǎng)片段DNA；（3）通過HLS直接獲取高質(zhì)量完整的目標(biāo)長(zhǎng)片段（HMW DNA）。后續(xù)可以匹配Nanopore、Pacbio、Illumina等測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行序列分析。

美國(guó)Universal Sequencing Technology公司（簡(jiǎn)稱UST）推出的TELL-Seq? 關(guān)聯(lián)長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)(Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing)，是一種基于二代測(cè)序平臺(tái)，可以在單個(gè)PCR管中對(duì)整個(gè)人類基因組實(shí)現(xiàn)測(cè)序的方法（如圖2）。但是對(duì)于研究單一或者少數(shù)基因位點(diǎn)的研究者來(lái)說(shuō)，不夠經(jīng)濟(jì)高效。因此，美國(guó)Universal Sequencing Technology公司與Sage Science公司聯(lián)合TELL-Seq和 HLS-CATCH技術(shù)，開發(fā)了一種優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法：靶向TELL-Seq。即使用HLS-CATCH技術(shù)獲取目標(biāo)基因片段后，再進(jìn)行TELL-Seq，最大限度地節(jié)約測(cè)序成本和數(shù)據(jù)分析時(shí)間。

近日，Sage Science公司發(fā)布了聯(lián)合TELL-Seq與 HLS-CATCH技術(shù)在MHC（major histocompatibility complex）基因單倍體分型的案例。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

針對(duì)MHC基因座（約4 MB），設(shè)計(jì)了兩種gRNA方案。第一種按照間隔400kb設(shè)計(jì)剪切位點(diǎn)，每個(gè)剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)3個(gè)gRNA（見圖3紅色框：set3）；第二種方案同樣按照間隔400kb設(shè)計(jì)剪切位點(diǎn)，但剪切位點(diǎn)與第一種相比偏移200kb（見圖3紫色框：set1）。兩種方案分別在HLS獨(dú)立運(yùn)行，獲取目標(biāo)400kb片段后，混合進(jìn)行TELL-Seq。

 

TELL-Seq文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)單且高效。DNA投入量為1ng，在單個(gè)PCR管中3小時(shí)即可實(shí)現(xiàn)TELL-Seq Linked Read Library構(gòu)建（圖4）。前期HMW DNA獲取對(duì)于后續(xù)單倍體分型分析至關(guān)重要，高質(zhì)量且完整的DNA才能精準(zhǔn)定位單倍體類型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

初步結(jié)果顯示，經(jīng)HLS-CATCH技術(shù)富集后，獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)于目標(biāo)MHC基因座具有足夠的覆蓋度（約180×），并且滿足單倍體分型測(cè)序數(shù)據(jù)要求。具體情況如圖5：

通過三代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行單倍體分型分析，一直具有高挑戰(zhàn)性和高成本的劣勢(shì)。而TELL-Seq技術(shù)的發(fā)展，使得在二代測(cè)序平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)單倍體分型成為可能。靶向TELL-Seq是單倍體分型的得力助手，一方面可以獲取高度準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)用于分析，另一方面又可以降低成本、檢測(cè)周期和DNA投入量。

應(yīng)用案例鏈接：https://sagescience.com/wp-content/uploads/2022/10/TELL-SEQ-MHC-App-Note.pdf

Sage Science是全球領(lǐng)先的全自動(dòng)核酸電泳片段回收儀的生產(chǎn)廠家，擁有美國(guó)技術(shù)專利，各個(gè)型號(hào)產(chǎn)品可以高效完成不同長(zhǎng)度范圍DNA片段的精準(zhǔn)回收，廣泛用于二代測(cè)序、三代測(cè)序以及多種分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。

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