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內(nèi)毒素試劑盒使用常見問題答疑

瀏覽次數(shù):410 發(fā)布日期:2023-10-31  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

Q1: 什么是內(nèi)毒素?

A1: 內(nèi)毒素是一種復(fù)雜的脂多糖(LPS),存在于大多數(shù)致病性革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜上。雖然煮沸 30 分鐘不會破壞內(nèi)毒素的穩(wěn)定性,但某些強(qiáng)氧化劑(如超氧化物、過氧化物和次氯酸鹽)可以降解內(nèi)毒素。


Q2: 可接受的最大內(nèi)毒素劑量是多少?
A2: 1 EU 大約相當(dāng)于 100 pg 的大腸桿菌脂多糖--大約 105 個(gè)細(xì)菌中的含量。人類只要接觸到5 EU/1kg 的內(nèi)毒素,就會出現(xiàn)癥狀。這些癥狀包括但不限于發(fā)燒、低血壓、心率加快和尿量少。即使血液中含有小劑量的內(nèi)毒素,也往往是致命的。
FDA對在美國銷售的藥品規(guī)定了以下最高允許內(nèi)毒素含量:
1.藥物(可注射,鞘內(nèi)注射)- 0.2 EU/1kg體重
2.藥物(可注射,非鞘內(nèi)注射)--5 EU/1kg體重
3.無菌水 - 0.25-0.5 EU/ml(取決于預(yù)期用途)


Q3: 我應(yīng)該選擇哪種內(nèi)毒素檢測方法?

A3: 在決定使用哪種內(nèi)毒素檢測試劑盒之前,您需要考慮幾個(gè)問題。首先,您要檢測多少樣本,檢測頻率如何?如果您只檢測一兩個(gè)樣品,而且只檢測一次,那么您可以考慮內(nèi)毒素檢測服務(wù)機(jī)構(gòu)。如果您計(jì)劃定期檢測,那么您首先需要評估您目前擁有的設(shè)備。如果您有多種可用設(shè)備,請考慮您希望獲得的結(jié)果類型。如果您必須獲得定量結(jié)果,那么凝膠法試劑盒將無法滿足您的需求,因?yàn)槟z法檢測只能得出定性的結(jié)果。檢測靈敏度是另一個(gè)重要的考慮因素。Kinetic-QCL™ 動態(tài)顯色 LAL 檢測法和 PyroGene™ 重組因子 C 檢測法的靈敏度都可低至 0.005 EU/mL。PYROGENT™-5000動態(tài)濁度LAL測定的讀數(shù)可達(dá)0.01 EU/mL。PYROGENT™凝膠法檢測試劑盒可訂購不同靈敏度的產(chǎn)品: 0.03、0.06、0.125 和 0.25 EU/mL。如果您需要經(jīng)常檢測許多樣品,那么您可能需要考慮購買尚未擁有的設(shè)備和軟件。與PYROGENT™凝膠法相比,光度法和重組C因子法所需的上手操作時(shí)間更短,靈敏度更高。


Q4: 進(jìn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 內(nèi)毒素檢測需要哪些設(shè)備?

A4: 不同的內(nèi)毒素檢測方法需要使用的設(shè)備可能也不同。如果使用PYROGENT™ 凝膠法檢測,需要一個(gè)非循環(huán)水浴鍋或一個(gè)能在 37°C 下加熱的干熱塊。如果Kinetic-QCL™ 或 PYROGENT™-5000檢測,則需要吸光度酶標(biāo)儀和內(nèi)毒素檢測分析軟件,該酶標(biāo)儀應(yīng)具有振蕩功能,能在 37°C 下孵育整個(gè)檢測過程,并能在 405 nm(用于 Kinetic-QCL)或 340 nm(用于 PYROGENT™-5000)波長下讀取動力學(xué)數(shù)據(jù)。如果使用PyroGene™ rFC 檢測,則需要使用配有 380/440 nm濾光片的孵育熒光酶標(biāo)儀。我們的所有試劑盒都需要使用漩渦混合器和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室移液器。


Q5: 在進(jìn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)時(shí),為什么要使用玻璃配件而不是塑料?

A5: 內(nèi)毒素在塑料表面的附著力比玻璃表面強(qiáng)。因此,我們建議在配制內(nèi)毒素對照標(biāo)準(zhǔn)(CSE)稀釋液時(shí)使用硼硅酸鹽玻璃稀釋管。在某些情況下,某些塑料可能被證明是可以接受的樣品容器。雖然玻璃仍是首選的樣品容器材料,但聚苯乙烯可能是第二選擇,聚丙烯則是第三選擇。一些客戶也表示使用 PET 材料效果不錯(cuò)。如果您計(jì)劃在檢測前將樣品保存一段時(shí)間,則應(yīng)驗(yàn)證樣品是否能在您計(jì)劃使用的容器中保存,并確認(rèn)樣品中的任何內(nèi)毒素在保存后都能被回收。


Q6: 在使用 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 進(jìn)行內(nèi)毒素檢測時(shí),為什么要對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 (CSE) 對照稀釋液進(jìn)行渦旋處理?

A6: 內(nèi)毒素會附著在玻璃表面,可以通過適當(dāng)?shù)臏u旋來復(fù)溶,以確保等分到反應(yīng)管或微孔板中的溶液濃度正確。在稀釋之前,應(yīng)將CSE小瓶渦旋15 分鐘。每次使用小瓶時(shí)都應(yīng)重復(fù)此操作,而不僅僅是在復(fù)溶后。每次使用 CSE 稀釋液前應(yīng)至少渦旋 1 分鐘。使用前最好立即將 CSE 稀釋液渦旋幾秒鐘。


Q7: 進(jìn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 內(nèi)毒素檢測時(shí),如何將 EU/ml(內(nèi)毒素單位)轉(zhuǎn)換為 ng/ml?

A7: 根據(jù)內(nèi)毒素來源的不同,從EU/ml到納克的換算也會有所不同。FDA最初將內(nèi)毒素單位(EU)定義為參考內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)EC-2中0.2 ng或5 EU/ng的內(nèi)毒素活性。將現(xiàn)行FDA RSE, EC-6從EU轉(zhuǎn)換為ng,轉(zhuǎn)換量為10 EU/ng。以前版本的BET<85>USP中規(guī)定,合適的CSE效價(jià)在2至50 EU/ng之間。


Q8: 在進(jìn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)時(shí),是否應(yīng)該使用匹配的試劑、CSE?

A8: 您需要使用匹配的試劑,以符合 FDA 對內(nèi)毒素檢測的要求。龍沙的每批 LAL 都使用美國參考標(biāo)準(zhǔn) EC-6 進(jìn)行功能測試。然后,通過與參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(RSE)平行測試,將該批次 LAL 與我們的對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(CSE)進(jìn)行 "匹配"。這種 RSE/CSE 相關(guān)性檢測可確定該批次 CSE 與該批次 LAL 一起使用時(shí)的效力。RSE/CSE 相關(guān)性測定的程序摘自美國食品及藥物管理局(FDA)關(guān)于將嗜酸性卵母細(xì)胞裂解物檢測法確認(rèn)為人和動物腸外藥品、生物制品和醫(yī)療器械最終產(chǎn)品內(nèi)毒素檢測法的指導(dǎo)原則。FDA 指出,使用 LAL 生產(chǎn)商出具的質(zhì)量證書,企業(yè)就無需自行進(jìn)行 RSE/CSE 比對。龍沙提供的試劑盒包含適用于我們所有檢測類型的匹配試劑,使您的內(nèi)毒素檢測更簡單。


Q9: 準(zhǔn)備運(yùn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑盒 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 時(shí),如何確定 CSE 的效力?

A9: 龍沙確定 CSE 效力的 RSE/CSE操作見每種匹配試劑盒的CoA。一般來說,將多瓶 CSE 的內(nèi)毒素稀釋液與用 RSE 生產(chǎn)的一系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行未知物測試。將 CSE 稀釋液的結(jié)果與 RSE 的結(jié)果進(jìn)行比較計(jì)算,得出以 EU/ml 為單位的效力。對于凝膠法,終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)的幾何平均數(shù)乘以靈敏度,即可確定以 EU/ml 為單位的效價(jià)。對于定量方法,對結(jié)果在所測 RSE 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的稀釋液進(jìn)行平均,以確定以 EU/ml 為單位的效價(jià)。要計(jì)算每納克的效價(jià),效價(jià)要乘以復(fù)溶CSE 所用的體積(例如 5 ml)和每個(gè)小瓶中凍干的相應(yīng)ng內(nèi)毒素。得出 EU/ng。


Q10: 在進(jìn)行 Lonza 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測 (BET)、LAL 或 PyroGene™ 重組因子 C (rFC) 內(nèi)毒素檢測試驗(yàn)時(shí),應(yīng)該如何處理 LAL 試劑?

A10: LAL 試劑應(yīng)輕拿輕放。復(fù)溶后,輕輕倒置或旋轉(zhuǎn)試劑瓶,試劑瓶中的內(nèi)容物很容易溶解。渦旋或劇烈搖晃重組的 LAL 試劑會使其起泡,不利于內(nèi)毒素檢測。

 

來源:上,|馳儀器有限公司
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