DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最重要的修飾之一，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。自引進大菱鲆（Scophthalmus maximus，商品名：多寶魚）以來，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，其間各種細(xì)菌、病毒和寄生蟲引起的疾病日益嚴(yán)重。因此，滅活疫苗以其獨特優(yōu)勢在水產(chǎn)品領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用。然而，大菱鲆接種殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）滅活疫苗后的免疫機制尚不清楚。
 
2023年2月7日，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院副教授修云吉博士團隊在《Frontiers in Immunology》雜志發(fā)表題為“Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation”的研究論文，該研究通過WGBS和對應(yīng)的RNA-seq分析，從DNA甲基化的角度揭示了殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫大菱鲆后的免疫機制。


標(biāo)題：Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation（從DNA甲基化角度分析殺鮭氣單胞菌滅活疫苗對大菱鲆的免疫作用）
時間：2023-02-07
期刊：Frontiers in Immunology
影響因子：7.3 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥?br />  
研究摘要：
本研究采用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）篩選差異甲基化區(qū)域（DMRs），采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）篩選顯著差異表達基因（DEGs）。雙熒光素酶報告實驗和DNA pull-down實驗進一步驗證了用殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫后基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平對基因轉(zhuǎn)錄活性的作用。
研究結(jié)果共篩選出8149個差異甲基化區(qū)域(differentially methylated regions, DMRs)，其中包括許多DNA甲基化水平變化的免疫相關(guān)基因。同時鑒定出386個顯著差異表達基因(DEGs)，其中許多基因在Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路和C型凝集素受體信號通路中顯著富集。結(jié)合WGBS結(jié)果和RNA-seq結(jié)果分析，共有9個負(fù)調(diào)控基因的DMRs位于啟動子區(qū)，包括2個低表達的高甲基化基因和7個高表達的低甲基化基因。隨后篩選出兩個免疫相關(guān)基因：C5a過敏毒素趨化受體1樣(C5ar1-Like)基因和嗜酸粒細(xì)胞過氧化物酶樣(EPX-Like)基因，以探討DNA甲基化修飾對其表達水平的調(diào)控機制。此外，基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平通過抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以影響基因轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致基因表達水平變化。
綜上，本研究通過共同分析WGBS和RNA-seq結(jié)果，從DNA甲基化角度揭示了大菱鲆用殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）滅活疫苗免疫后發(fā)生的免疫機制。
 
材料方法：

研究結(jié)果：
（1）轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析
表2：樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量

表3：樣本和參考基因組的比對

圖1：轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異基因。
（A） Venn圖顯示了AsVSm和NVSm基因的差異。
（B） 條形圖顯示了顯著DEG數(shù)量的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
（C） 顯著DEG的聚類熱圖。橫坐標(biāo)表示樣品名稱，縱坐標(biāo)表示均質(zhì)化后fpkm的值。紅色表示高表達，綠色表示低表達。
（D） 顯著DEG的GO富集分析。
（E） KEGG富集散點圖。AsVSm與NVSm中最顯著富集DEG的前20條通路。
 
（2）全基因組重亞硫酸鹽測序分析
表4：WGBS的output數(shù)據(jù)質(zhì)量

表5：WGBS中reads與參考基因組的比率

表6：全基因組甲基化水平


表7：mC的數(shù)量和百分比分布


圖2：通過全基因組亞硫酸鹽測序篩選DMR和相關(guān)基因。
（A）基因區(qū)域上游和下游2K區(qū)域樣本甲基化水平分布。
（B）mCG序列環(huán)境中基因功能區(qū)甲基化水平的熱像圖分析結(jié)果。
（C）DMGs在不同序列環(huán)境（CG，CHG，CHH）中錨定啟動子區(qū)域的共有和獨有基因集數(shù)量。
（D）不同序列環(huán)境（CG，CHG，CHH）中DMR甲基化水平的聚類熱圖。
（E）在CG序列環(huán)境中DMG的GO富集分析。
（F）在CG序列環(huán)境中DMGs顯著富集的前20個通路。


（3）WGBS與RNA-seq的關(guān)聯(lián)分析


圖3：甲基化修飾對基因表達水平的調(diào)控
(A) CG序列環(huán)境中基因表達水平和甲基化水平的分布。
(B) DMG和DEGs之間重疊基因的統(tǒng)計。
(C)啟動子區(qū)CG序列環(huán)境中重疊基因的GO富集分析。
(D)顯著富集甲基化負(fù)調(diào)控基因的通路統(tǒng)計。


（4）DNA甲基化負(fù)調(diào)控基因表達
圖4：DNA甲基化負(fù)調(diào)控基因表達
(A) AsVSm組和NVSm組中C5ar1-Like基因的相對表達水平。
(B) AsVSm組和NVSm組C5ar1-Like基因啟動子區(qū)平均甲基化水平。
(C) AsVSm組和NVSm組EPX-Like基因的相對表達量。
(D) AsVSm組和NVSm組EPX-Like基因啟動子區(qū)平均甲基化水平。* p < 0.05。
 
 
（5）DNA甲基化抑制免疫相關(guān)基因表達的機制
圖5：DNA甲基化抑制免疫相關(guān)基因表達的機制
(A)來自C5ar1-Like和EPX-Like啟動子區(qū)的擴增片段。不同顏色代表不同的基因片段。
(B) DNA甲基化修飾對C5ar1-Like啟動子區(qū)熒光活性的影響。
(C) DNA甲基化修飾對EPX-Like啟動子區(qū)熒光活性的影響。*代表性顯著性差異(P<0.05)。
(D) HEK293T核蛋白的考馬斯藍染色(coomassie blue staining)。
(E) DNA pull down富集蛋白的銀染色（Silver staining）。紅框顯示met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like的不同條帶。
(F) MS鑒定的met-SmC5ar1-Like和SmC5ar1-Like互作蛋白的總數(shù)。

研究小結(jié)：
本研究通過WGBS和RNA-seq等分析表明，在接種殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）滅活疫苗后，大菱鲆腎組織中許多DNA甲基化水平和基因表達發(fā)生變化。此外，雙熒光素酶報告實驗和DNA pull down結(jié)果驗證了基因啟動子區(qū)DNA甲基化修飾可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)結(jié)合而影響基因表達。本研究結(jié)果揭示了滅活疫苗對大菱鲆腎組織DNA甲基化水平和基因表達的影響，探索了DNA甲基化在大菱鲆抗性育種中的潛在應(yīng)用，為大菱鲆遺傳改良提供了新思路。


參考文獻：
Li Y, Su L, Liu X, Guo H, Zhou S, Xiu Y. Immunity of turbot Induced by inactivated vaccine of Aeromonas salmonicida from the perspective of DNA methylation. Front Immunol. 2023;14:1124322.