自從1977年一代測(cè)序被發(fā)明以來(lái)，測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展。 從一代sanger測(cè)序，發(fā)展到二代測(cè)序，現(xiàn)在已經(jīng)到了三代全長(zhǎng)測(cè)序。 其中二代測(cè)序相比于一代測(cè)序，通過(guò)將核酸片段化進(jìn)行平行大規(guī)模測(cè)序，大大增加了測(cè)序的效率。早期的二代效率集中在全基因組測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，盡管測(cè)序的效率有所增加，成本有所降低。 但是測(cè)序數(shù)據(jù)依然非常龐大，為了更進(jìn)一步的節(jié)省成本，提高效率，靶向測(cè)序應(yīng)運(yùn)而生。

 

靶向測(cè)序定義：將基因組中感興趣的區(qū)域或者位點(diǎn)富集出來(lái)，然后使用二代測(cè)序（NGS）方法去進(jìn)行測(cè)序，包含全外顯子組（基因組蛋白編碼區(qū)域），針對(duì)感興趣的特定基因定制測(cè)序panel等。

 

靶向捕獲測(cè)序背景

1977年 Walter Gilbert和Frederick Sanger發(fā)明了第一臺(tái)測(cè)序儀，使用鏈終止法測(cè)序其測(cè)定了第一個(gè)基因組序列，噬菌體X174，全長(zhǎng)5375個(gè)堿基。Sanger 測(cè)序的發(fā)明，標(biāo)志著基因測(cè)序技術(shù)正式進(jìn)入生命科學(xué)研究舞臺(tái)

1988年Chambehian等人首次提出多重PCR技術(shù)，為后續(xù)多重PCR擴(kuò)增子測(cè)序打下基礎(chǔ)[1]

2005年Nature Method 上發(fā)表了一篇名為《Direct genomic selection》的文章，該文章利用長(zhǎng)度為150kb生物素標(biāo)記的BAC DNA和經(jīng)過(guò)處理的人類基因組DNA進(jìn)行雜交，通過(guò)鏈霉親和磁珠對(duì)DNA片段進(jìn)行捕獲，后續(xù)又經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明約~50%的序列來(lái)自于靶標(biāo)區(qū)域

 

 

2008年，安捷倫聯(lián)合Broad研究所，將其超長(zhǎng)寡核苷酸合成技術(shù)和平行測(cè)序相結(jié)合，在Nature Biotechnology發(fā)表文章，奠定安捷倫雜交捕獲測(cè)序方法學(xué)基礎(chǔ)。

 

 

2009年，安捷倫聯(lián)合華盛頓大學(xué)在Nature上發(fā)表文章，使用靶向捕獲測(cè)序技術(shù)檢測(cè)人類外顯子

 

 

同年安捷倫推出了世界上第一款商品化人類全外顯子探針產(chǎn)品。

2021 年 4 月，安捷倫宣布首款基于機(jī)器學(xué)習(xí)探針設(shè)計(jì)方案的全外產(chǎn)品—人全外顯子組 V8 (SureSelect Human All Exon V8) 正式在中國(guó)上市，繼續(xù)書寫人全外顯子靶向捕獲技術(shù)新篇章。

2022年春， Qiagen 基于多重PCR技術(shù)全新一代 QIAseq Targeted DNA Pro 在中國(guó)正式上市

 

目前常用的靶向測(cè)序用兩種方法：靶向捕獲法和多重PCR法（又稱擴(kuò)增子測(cè)序）

 

雜交捕獲法

雜交捕獲法是一種把分子雜交和二代測(cè)序相結(jié)合的靶向測(cè)序技術(shù)。 該技術(shù)需要設(shè)計(jì)和生產(chǎn)和目的區(qū)域互補(bǔ)的探針，通過(guò)探針將目的區(qū)域的片段捕獲下來(lái)，再將不需要的部分進(jìn)行洗脫。 根據(jù)雜交的狀態(tài)又可分為固相雜交和液相雜交。固相雜交就是將設(shè)計(jì)好的探針固相的芯片上探針，通過(guò)探針將目標(biāo)區(qū)段捕獲。液相雜交的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)是在液體狀態(tài)中完整，探針攜帶生物素，當(dāng)雜交完成后，通過(guò)鏈酶親和磁珠將探針吸附下來(lái)（此時(shí)探針有攜帶目標(biāo)區(qū)段的和空探針），未被捕獲的片段被洗脫掉，再通過(guò)變性將探針和目標(biāo)片段分開(kāi)，然后利用磁珠將所有空探針吸附丟棄，完成捕獲。
 

圖 1 安捷倫雜交捕獲測(cè)序流程

 

多重PCR法

多重PCR靶向測(cè)序技術(shù)又稱擴(kuò)增子靶向測(cè)序技術(shù)，是一種將多重PCR技術(shù)與二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的一種靶向測(cè)序技術(shù)。 該技術(shù)首先利用多重PCR反應(yīng)，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)區(qū)域序列，得到擴(kuò)增子產(chǎn)物，然后通過(guò)PCR反應(yīng)或者酶連接反應(yīng)，將二代測(cè)序所需的接頭序列（adapter）引入到擴(kuò)增子產(chǎn)物的兩側(cè)，得到擴(kuò)增子文庫(kù)，然后進(jìn)行二代測(cè)序和生信流程分析，獲取目標(biāo)區(qū)域的序列信息，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域序列檢測(cè)的目的。常見(jiàn)的多重PCR靶向測(cè)序舉例：tNGS病原微生物靶向測(cè)序，用于分析病原微生物的群落組成和分布，來(lái)進(jìn)行臨床病原微生物的診斷。

 

圖 2 Qiagen 基于SPE技術(shù)的多重PCR靶向測(cè)序流程

 

全基因組 vs 全外顯子 vs 多重PCR

	全基因組測(cè)序	全外顯子測(cè)序（雜交捕獲）	Panel( 多重PCR)
目標(biāo)區(qū)域大小	3 G (human)	50 M	10 kb-5 M (variable)
覆蓋基因組范圍	100%	1.3%	<0.1% (variable)
文庫(kù)構(gòu)建成本	60-150	～600	100-800 (variable)
一般測(cè)序深度	30x	100x	500-10000x
測(cè)序數(shù)據(jù)量	90 Gb	5 Gb	1 Gb (variable)
測(cè)序成本	4500	250	50
數(shù)據(jù)儲(chǔ)存成本	Very High	High	Low
生信分析難度	High  Complexity	Medium Complexity	Low  Complexity

 

數(shù)據(jù)評(píng)估

目標(biāo)基因區(qū)域捕獲的數(shù)據(jù)質(zhì)量主要通過(guò)以下指標(biāo)評(píng)價(jià)：目標(biāo)區(qū)域覆蓋度、捕獲效率、目標(biāo)區(qū)域覆蓋均一性等[2]。

目標(biāo)區(qū)域覆蓋度：指檢測(cè)到的區(qū)域相比目標(biāo)區(qū)域的比例，最理想的情況就是感興趣的目標(biāo)區(qū)域都能夠被覆蓋到。但是由于在設(shè)計(jì)探針的時(shí)候會(huì)考慮各種因素，如GC含量、序列的特征、序列的拷貝數(shù)，序列相似性等問(wèn)題，為了保證整體的基因捕獲效率，會(huì)選擇放棄一小部分區(qū)域的捕獲，這個(gè)比例約為0-3%。原則上來(lái)講，目標(biāo)覆蓋度越高，探針或者多重PCR產(chǎn)品的性能也就越好。

捕獲效率：落在目標(biāo)區(qū)域的數(shù)據(jù)占總數(shù)據(jù)的比例。捕獲效率越高，代表測(cè)序數(shù)據(jù)的利用率越高。另外在設(shè)計(jì)探針時(shí)，需要評(píng)估覆蓋位置的序列特征，如果探針有很多落在重復(fù)序列區(qū)域，或者高拷貝序列區(qū)，則探針會(huì)結(jié)合較多的非目標(biāo)區(qū)域。設(shè)計(jì)更加特異性的探針能夠有效減少非特異序列的結(jié)合，提升捕獲效率。

 

通常影響捕獲效率的因素有以下幾點(diǎn)[3]：

1.高GC區(qū)域 - UTRs 和 啟動(dòng)子區(qū)域通常是非常典型的高CG含量區(qū)域，這部分區(qū)域往往是低捕獲效率，并且會(huì)增加這些區(qū)域和其他區(qū)域的捕獲差別

2.DNA 質(zhì)量- 投入的DNA質(zhì)量較差, 例如FFPE樣本提取的DNA，會(huì)產(chǎn)生捕獲偏差，因?yàn)檫@樣樣本中部分區(qū)域往往比其他區(qū)域碎片更多。如果捕獲不平衡，就會(huì)在下游 SNP s和其他形式的分析中產(chǎn)生偏差。建議用安捷倫自動(dòng)化電泳儀器對(duì)核酸樣本進(jìn)行質(zhì)控，例如2100生物分析儀，Tapestation分析儀，F(xiàn)ragment analyzer等

3.DNA 投入量 - Low input DNA 在建庫(kù)過(guò)程中往往需要更多的PCR循環(huán)數(shù)來(lái)或足夠量的預(yù)文庫(kù)。增加PCR循環(huán)數(shù)，會(huì)造成更多的PCR duplicates, 會(huì)降低最終數(shù)據(jù)的有用信息。隨著技術(shù)發(fā)展，目前靶向測(cè)序所需DNA投入量已由傳統(tǒng)的微克級(jí)別下降至ng級(jí)別

4.Pseudogenes -會(huì)降低覆蓋率的均勻性

5.DNA片段大小 - 建議片段大小應(yīng)和探針設(shè)計(jì)大小想匹配以獲得更大的捕獲效率，建議用安捷倫自動(dòng)化電泳儀器對(duì)樣本核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，例如2100生物分析儀，Tapestation分析儀，F(xiàn)ragment analyzer等

6.Repeat elements - 會(huì)降低reads在外顯子組中分布的均勻性，導(dǎo)致需要更多的測(cè)序來(lái)檢測(cè)新的SNP。

 

覆蓋均一性：指每個(gè)區(qū)域的覆蓋深度是不是均勻。要想獲得高均一性覆蓋度的數(shù)據(jù)，在預(yù)文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，要保證文庫(kù)的均一性要好。例如文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，采用無(wú)序列偏差的DNA片段化方法；采用對(duì)GC含量偏好性低的擴(kuò)增酶；減少PCR富集的循環(huán)數(shù)；如果使用探針雜交捕獲方法，探針設(shè)計(jì)時(shí)要更好的計(jì)算探針的結(jié)合能力，合理調(diào)整探針比例，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用高度優(yōu)化的雜交緩沖液進(jìn)行捕獲實(shí)驗(yàn)。