293T細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過表達(dá)各種重組蛋白或病毒包裝，其優(yōu)點(diǎn)包括高轉(zhuǎn)染效率、低成本的放大性和人糖基化模式^[1]。隨著基因治療和細(xì)胞治療的飛速發(fā)展，293T細(xì)胞越來(lái)越多地應(yīng)用于腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體，重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體及慢病毒的生產(chǎn)^[2]。為實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模的GMP生產(chǎn)要求以滿足基因治療、細(xì)胞治療領(lǐng)域相關(guān)研發(fā)和臨床實(shí)驗(yàn)，越來(lái)越多的研究人員將目光轉(zhuǎn)向了生物反應(yīng)器工藝。

從培養(yǎng)箱到生物反應(yīng)器工藝過程中，有三大挑戰(zhàn)。首先，293T原本是貼壁細(xì)胞屬性，需要貼附在載體表面進(jìn)行生長(zhǎng)。目前最常用的貼壁載體為Cytodex1球狀載體，如Vero細(xì)胞在這個(gè)體系下細(xì)胞密度可達(dá)到1.0×10⁷ cells/mL以上。但293T細(xì)胞的貼壁牢固性較Vero細(xì)胞這類貼壁細(xì)胞弱，在微載體攪拌的過程中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的脫落和死亡，因此在生產(chǎn)應(yīng)用中仍有所限制。其次，貼壁的293T細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中需要添加血清等動(dòng)物源成分，影響了后期的質(zhì)量控制。最后，貼壁細(xì)胞在逐級(jí)放大過程中受到細(xì)胞消化效率的限制。面對(duì)這些挑戰(zhàn)，有研究人員將293T細(xì)胞馴化成無(wú)血清懸浮細(xì)胞株，解決了以上問題，但細(xì)胞密度只能在10⁶ cells/mL水平^[3]。

生物反應(yīng)器作為大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的有利工具，已經(jīng)被應(yīng)用到293T懸浮培養(yǎng)工藝中。然而通常的批次模式下，營(yíng)養(yǎng)成分的耗竭及代謝副產(chǎn)物的積累往往限制細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝，流加（Fed-batch）培養(yǎng)工藝因其操作簡(jiǎn)單、過程放大容易、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)已成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主流模式。因此我們用293T 懸浮細(xì)胞在CloudReady™ 500mL生物反應(yīng)器系統(tǒng)上進(jìn)行了Fed-batch 培養(yǎng)，為293T懸浮細(xì)胞高密度表達(dá)提供參考（圖1），為病毒載體生產(chǎn)工藝提供新的可行性。
 

圖1 CloudReady™ 500mL生物反應(yīng)器系統(tǒng)

操作過程

本次實(shí)驗(yàn)以5×10⁵ cells/mL的細(xì)胞密度接種，將空氣和氧氣級(jí)聯(lián)DO，CO₂ 和 0.5 mol/L NaOH溶液級(jí)聯(lián)pH。其他參數(shù)控制和補(bǔ)料控制見表1和表2。另外，在第八天根據(jù)細(xì)胞實(shí)際情況又額外補(bǔ)加了10mL 293瞬轉(zhuǎn)表達(dá)用補(bǔ)料A和1mL 293瞬轉(zhuǎn)表達(dá)用補(bǔ)料B。

表1 工藝控制參數(shù)設(shè)定

 

結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)217h的培養(yǎng)周期，經(jīng)過上述條件的控制，最終細(xì)胞密度達(dá)到了2.28×10⁷ cells/mL，并且活率維持在93%以上（圖2）。實(shí)驗(yàn)過程中沒有通入0.5 mol/L NaOH溶液，pH最低值維持在6.7以上（圖3）。根據(jù)CARE（迪必爾生物應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心）前期培養(yǎng)293T細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，pH控制在6.9-7.3，會(huì)造成大量的乳酸積累，培養(yǎng)期間持續(xù)增加至4.41g/L^[4]

此次實(shí)驗(yàn)通過降低了pH設(shè)定值，乳酸濃度最大不超過2g/L，最后穩(wěn)定在1.5g/L左右（圖4）。這樣的結(jié)果給下一步利用微小型平行生物反應(yīng)器進(jìn)行工藝優(yōu)化提供了一定的參考。
 

圖2 239T細(xì)胞培養(yǎng)過程增殖曲線,“Fed”指補(bǔ)加293瞬轉(zhuǎn)表達(dá)用補(bǔ)料A和B兩種培養(yǎng)基。


圖3 293T細(xì)胞培養(yǎng)周期參數(shù)控制趨勢(shì)圖：紅色-溫度；黑色-pH;綠色-DO；黃色-轉(zhuǎn)速（rpm）；藍(lán)色-CO₂流速（mL/min）；灰色-空氣流速（mL/min）；橙色-氧氣流速（mL/min）。


圖4 239T細(xì)胞培養(yǎng)過程葡萄糖消耗曲線和乳酸鹽代謝曲線。

參考文獻(xiàn)

[1]. DEKEVIC G, TASTO L, CZERMAK P, et al. Statistical experimental designs to optimize the transient transfection of HEK 293T cells and determine a transfer criterion from adherent cells to larger-scale cell suspension cultures [J]. J Biotechnol, 2022, 346: 23-34.

[2]. ABAANDOU L, QUAN D, SHILOACH J. Affecting HEK293 Cell Growth and Production Performance by Modifying the Expression of Specific Genes [J]. Cells, 2021, 10(7).

[3]. TANG Q, GU L, WU H, et al. Establishing 293T suspension cultrue for lentiviral vector production in a stirred bioreactor [J]. 2020.

[4]. 汪興. HEK 293T細(xì)胞在一次性生物反應(yīng)器（3L）的懸浮培養(yǎng)工藝. 迪必爾生物工程（上海）有限公司. 2023

CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器（圖5）整合了多種補(bǔ)料策略，同時(shí)內(nèi)置DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析軟件可以幫助用戶快速地進(jìn)行布局實(shí)驗(yàn)，縮短產(chǎn)品的開發(fā)周期。

圖5 CloudReady™ 第6代平行生物反應(yīng)器