細菌微生物基因表達調控表觀研究方案之原核三代甲基化及轉錄組測序
原核甲基化
Ø 原核生物甲基化為什么基于三代測序？
第三代DNA測序為原核細菌的甲基化和表觀遺傳的研究開辟了一條新的途徑，能夠在基因組的水平上獲取整個表觀遺傳的序列信息，繪制全基因組甲基化組。
Ø 細菌全基因組甲基化納米孔測序(ONT)
原核轉錄組（mRNA+sRNA）
原核轉錄組測序可以從基因表達量、基因結構和sRNA調控功能三維度揭示不同生物性狀的分子調控機制。如通過計算各組間的差異基因并對差異基因進行富集分析，獲得對生物性狀影響較大的通路信息；通過預測基因的反義轉錄本，豐富基因組注釋內容；研究sRNA對mRNA的相互作用，從分子調控角度解釋生物性狀之間的差異。
Ø 細菌中轉錄組研究意義
轉錄技術在原核生物轉錄組研究上的突破，已經(jīng)顯示出其在揭示原核生物生命過程的分子機制上獨特的優(yōu)勢。對原核生物的轉錄組研究開始于致病菌，但不止步于致病菌。近年來，原核轉錄組已成為一種普遍的研究方法，而通過轉錄組學分析環(huán)境脅迫、抗菌藥物、生防細菌處理下的原核生物更早已成為研究熱點。
l 基因表達量分析
l 差異基因鑒定
易基因專利技術：針對檢測原核菌個性化設計rRNA去除探針，利用高通量技術對原核細胞所產(chǎn)生的所有mRNA和sRNA（非編碼RNA）進行測序。系統(tǒng)全面解析特定細胞所產(chǎn)生的mRNA和sRNA對生物性狀的影響。
同時分析sRNA與mRNA的互作關系，更加全面解讀表達互作網(wǎng)絡。
原核甲基化+轉錄組組學關聯(lián)分析
原核甲基化+轉錄組聯(lián)合分析可同時實現(xiàn)從“因”和“果”兩個層面研究生物學問題，串聯(lián)證據(jù)，并對其相關性進行驗證，從不同的角度合力探索和解釋生物學問題。 
判斷組學之間是否可以進行關聯(lián)：是否有關聯(lián)的生物學理論基礎？
如：
• 啟動子區(qū)甲基化會抑制基因的表達；
• 基因主體甲基化與基因表達正相關等。
因果關系的論證一般需要嚴密的分子實驗。 
研究案例
技術平臺：原核甲基化測序分析
實驗樣本：痤瘡表皮桿菌(C. acnes)
研究背景：
痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽性細菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是最豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾�。ㄈ琊畀彛┯嘘P。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉移酶，其中一些可能屬于保護入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。
研究結果：
在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達證實了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對噬菌體感染的抗性。
圖1：C.acnes KPA171202（SLST H2）具有在AGCAGY序列甲基化motif的功能性R-M系統(tǒng)。
圖2：C.acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染性狀并保護細菌免受裂解。
文章期刊：CHEMOSPHERE 202205
影響因子：IF 8.8
技術平臺：原核轉錄組測序分析、WGCNA分析
實驗樣本：微藻
研究背景：
由于鎘(Cd)的生物蓄積性和生物不可降解性，即使在低濃度下，鎘也會對生態(tài)系統(tǒng)構成嚴重威脅。微藻是一種很有前途的重金屬去除劑和有效的工業(yè)污水凈化劑。然而，關于鎘脅迫下微藻的短期和長期響應分子機制的詳細報道很少。本研究對微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行為（生長曲線、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)動態(tài)變化）、細胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和脅迫響應機制進行探討。
研究結果：
本研究通過原核生物的轉錄組RNA-seq在對照和15 min、48 h、72 h和96 h處理組中檢測到1413個差異表達基因（DEGs）。這些基因被證明是鎘敏感DEGs，且與核糖體、氮代謝、硫轉運蛋白和光合作用相關。WGCNA（加權基因共表達網(wǎng)絡分析）揭示了兩種主要的基因表達模式：短期響應（381個基因）和長期響應（364個基因）。DEGs富集分析表明，參與氮（N）代謝、硫轉運蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表達顯著上調，為初期合成金屬螯合蛋白、抗性金屬蛋白和轉運蛋白（ABC轉運蛋白）的重要組分（半胱氨酸）提供了原料，是一種短期響應機制。前15分鐘的Cd吸附主要依賴于膜轉運蛋白和預先蓄積的EPS。同時，上調的谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）家族蛋白在外源性鎘的初始抗性中發(fā)揮作用。受損的光合系統(tǒng)在后期得到修復，糖酵解和糖異生表達上調，滿足生理代謝活動的能量和物質。本研究首次提供了微藻響應鎘脅迫的短期和長期分子機制。同時，本研究中鑒定的關鍵基因可以作為藻類基因工程的潛在靶點。
參考文獻：
Knödlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.
Tian Q, et al. Longitudinal physiological and transcriptomic analyses reveal the short term and long term response of Synechocystis sp. PCC6803 to cadmium stress. Chemosphere. 2022 Sep;303(Pt 1):134727.
- 原核生物中的DNA甲基化
Ø 原核生物甲基化為什么基于三代測序？
第三代DNA測序為原核細菌的甲基化和表觀遺傳的研究開辟了一條新的途徑，能夠在基因組的水平上獲取整個表觀遺傳的序列信息，繪制全基因組甲基化組。
Matthew J. Blow等人通過對200多種不同的細菌和其他原核生物，例如古細菌等研究發(fā)現(xiàn)，超過90％的原核生物中都存在DNA甲基化，并且有600多個甲基轉移酶，表明存在大量的甲基化修飾多樣性。
研究還觀察到了許多其他的DNA甲基化模式（甚至包含沒有限制性內切系統(tǒng)）。這表明DNA甲基化系統(tǒng)在原核生物中參與基因組調控，并在原核生物的生理生化中有著至關重要的作用，如調節(jié)毒力、抗生素耐藥性，及適應氧化、缺氧、營養(yǎng)匱乏、酸性 pH 等環(huán)境。
Ø 細菌全基因組甲基化納米孔測序(ONT)
- 技術路線
- 技術優(yōu)勢
- 平均讀長＞10Kbp，最長可達2M左右，直接跨越重復序列、高度多態(tài)性區(qū)域等特殊區(qū)域；
- 無需PCR擴增，可直接保留并檢測DNA甲基化修飾；
- 可同時檢測全基因組范圍單堿基的5mC與6mA修飾位點，并給出單堿基的甲基化水平；
- ONT測序成本相對于二代NGS測序技術大幅降低。
原核轉錄組（mRNA+sRNA）
原核轉錄組測序可以從基因表達量、基因結構和sRNA調控功能三維度揭示不同生物性狀的分子調控機制。如通過計算各組間的差異基因并對差異基因進行富集分析，獲得對生物性狀影響較大的通路信息；通過預測基因的反義轉錄本，豐富基因組注釋內容；研究sRNA對mRNA的相互作用，從分子調控角度解釋生物性狀之間的差異。
Ø 細菌中轉錄組研究意義
轉錄技術在原核生物轉錄組研究上的突破，已經(jīng)顯示出其在揭示原核生物生命過程的分子機制上獨特的優(yōu)勢。對原核生物的轉錄組研究開始于致病菌，但不止步于致病菌。近年來，原核轉錄組已成為一種普遍的研究方法，而通過轉錄組學分析環(huán)境脅迫、抗菌藥物、生防細菌處理下的原核生物更早已成為研究熱點。
l 基因表達量分析
l 差異基因鑒定
- 非編碼RNA鑒定等
易基因專利技術：針對檢測原核菌個性化設計rRNA去除探針，利用高通量技術對原核細胞所產(chǎn)生的所有mRNA和sRNA（非編碼RNA）進行測序。系統(tǒng)全面解析特定細胞所產(chǎn)生的mRNA和sRNA對生物性狀的影響。
- 技術路線
- 技術優(yōu)勢
同時分析sRNA與mRNA的互作關系，更加全面解讀表達互作網(wǎng)絡。
原核甲基化+轉錄組組學關聯(lián)分析
原核甲基化+轉錄組聯(lián)合分析可同時實現(xiàn)從“因”和“果”兩個層面研究生物學問題，串聯(lián)證據(jù)，并對其相關性進行驗證，從不同的角度合力探索和解釋生物學問題。
判斷組學之間是否可以進行關聯(lián)：是否有關聯(lián)的生物學理論基礎？
如：
• 啟動子區(qū)甲基化會抑制基因的表達；
• 基因主體甲基化與基因表達正相關等。
因果關系的論證一般需要嚴密的分子實驗。
研究案例
- 原核甲基化研究案例
文章期刊：PLoS Pathog 202203
影響因子：IF 6.7技術平臺：原核甲基化測序分析
實驗樣本：痤瘡表皮桿菌(C. acnes)
研究背景：
痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽性細菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是最豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾�。ㄈ琊畀彛┯嘘P。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉移酶，其中一些可能屬于保護入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。
研究結果：
在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達證實了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對噬菌體感染的抗性。
圖2：C.acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染性狀并保護細菌免受裂解。- 原核轉錄組研究案例
文章期刊：CHEMOSPHERE 202205影響因子：IF 8.8
技術平臺：原核轉錄組測序分析、WGCNA分析
實驗樣本：微藻
研究背景：
由于鎘(Cd)的生物蓄積性和生物不可降解性，即使在低濃度下，鎘也會對生態(tài)系統(tǒng)構成嚴重威脅。微藻是一種很有前途的重金屬去除劑和有效的工業(yè)污水凈化劑。然而，關于鎘脅迫下微藻的短期和長期響應分子機制的詳細報道很少。本研究對微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行為（生長曲線、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)動態(tài)變化）、細胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和脅迫響應機制進行探討。
研究結果：
本研究通過原核生物的轉錄組RNA-seq在對照和15 min、48 h、72 h和96 h處理組中檢測到1413個差異表達基因（DEGs）。這些基因被證明是鎘敏感DEGs，且與核糖體、氮代謝、硫轉運蛋白和光合作用相關。WGCNA（加權基因共表達網(wǎng)絡分析）揭示了兩種主要的基因表達模式：短期響應（381個基因）和長期響應（364個基因）。DEGs富集分析表明，參與氮（N）代謝、硫轉運蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表達顯著上調，為初期合成金屬螯合蛋白、抗性金屬蛋白和轉運蛋白（ABC轉運蛋白）的重要組分（半胱氨酸）提供了原料，是一種短期響應機制。前15分鐘的Cd吸附主要依賴于膜轉運蛋白和預先蓄積的EPS。同時，上調的谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）家族蛋白在外源性鎘的初始抗性中發(fā)揮作用。受損的光合系統(tǒng)在后期得到修復，糖酵解和糖異生表達上調，滿足生理代謝活動的能量和物質。本研究首次提供了微藻響應鎘脅迫的短期和長期分子機制。同時，本研究中鑒定的關鍵基因可以作為藻類基因工程的潛在靶點。
參考文獻：
Knödlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.
Tian Q, et al. Longitudinal physiological and transcriptomic analyses reveal the short term and long term response of Synechocystis sp. PCC6803 to cadmium stress. Chemosphere. 2022 Sep;303(Pt 1):134727.
標簽：
RRBS
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com