免疫細(xì)胞（immune cells）是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，其在免疫細(xì)胞療法中扮演著至關(guān)重要的角色。免疫細(xì)胞療法，即通過采集身體中的免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，擴(kuò)增，最后回輸?shù)襟w內(nèi)，來增強(qiáng)機(jī)體對疾病的抵抗能力。因此免疫細(xì)胞培養(yǎng)至關(guān)重要。為此，小優(yōu)創(chuàng)建了《免疫細(xì)胞培養(yǎng)通關(guān)技巧合集》，將為大家詳細(xì)地介紹免疫細(xì)胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細(xì)胞分選、分型鑒定、擴(kuò)增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。今天我們先一起學(xué)習(xí)樣本制備！
 

首先，我們需要認(rèn)識一下免疫細(xì)胞。按照來源，免疫細(xì)胞可分為髓系和淋巴兩類。骨髓是各類血細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞）的發(fā)源地，骨髓中的造血干細(xì)胞具有高度自我更新能力和多能分化潛力，在骨髓造血微環(huán)境的影響下，經(jīng)過定向祖細(xì)胞。前體細(xì)胞等分化階段，最終分化成熟為各種血細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞）（圖1）。了解免疫細(xì)胞的分化歷程及相關(guān)的細(xì)胞因子是十分重要的，有助于我們在擴(kuò)增&培養(yǎng)階段根據(jù)細(xì)胞的類型添加不同的生長因子，從而滿足細(xì)胞的營養(yǎng)需要。

 

圖1 免疫細(xì)胞的分化歷程及相關(guān)細(xì)胞因子（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

 

除此之外，我們也要了解免疫細(xì)胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例，如此，我們才能選擇目的免疫細(xì)胞相對富集的樣本進(jìn)行單細(xì)胞懸液的制備。以下列舉了人外周血，小鼠脾臟、外周血和淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞的比例，供大家參考（表1和表2）。

 

表1 人外周血免疫細(xì)胞的比例

 

表2 小鼠脾臟、外周血、淋巴結(jié)免疫細(xì)胞的比例

 

做好以上的知識準(zhǔn)備后，就來到我們的樣本制備啦！
 

在正式的樣本制備之前，我們還需進(jìn)行樣本采集和預(yù)處理。根據(jù)目的免疫細(xì)胞的分化以及血液和免疫器官分布，選擇合適的樣本，新鮮取材，并進(jìn)行相關(guān)的預(yù)處理。
 

血液：從血液中制備PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群的一個常見方法。采集血液樣品后，要裝入含適當(dāng)抗凝劑的容器中防止凝集，并且血液要與抗凝劑充分輕柔混勻。不同的抗凝劑其抗凝原理略有不同，小優(yōu)也為大家整理了常見抗凝劑的原理及優(yōu)缺點(diǎn)（表3）。目前來說，適合后續(xù)免疫細(xì)胞培養(yǎng)的抗凝劑是肝素抗凝劑。

 

表3 常用抗凝劑匯總

 

實(shí)體組織：實(shí)體組織的預(yù)處理相對簡單，主要是組織的清洗。使用培養(yǎng)基或PBS等清洗組織上殘留的血液，并剔除相關(guān)的結(jié)締組織，整合過程中也一定要保證無菌。

 

注意事項：

①樣本的取材一定要新鮮無菌，這樣才能保證細(xì)胞的狀態(tài)。

②血液要與抗凝劑輕柔混勻，劇烈晃動可導(dǎo)致溶血。

③血液采集后，需進(jìn)行檢測以保證質(zhì)量及無菌。

 

樣本制備（Sample Preparation）：免疫細(xì)胞的來源可分為血液和各種實(shí)體組織，由此，樣本制備的方法則分為PBMC的制備和實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液。

1、單個核細(xì)胞（PBMC）的制備方法主要是密度梯度離心，其原理為血液中各細(xì)胞成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的Ficoll分離液作密度梯度離心時，各成分將按密度梯度聚集。

具體步驟如下：

1.收集抗凝血，用PBS按照1:1的比例稀釋，輕輕上下顛倒混勻；

2.在15 mL離心管中，先加入3 mL充分混勻的Ficoll液（1.077密度），再沿著管壁小心加入2 mL稀釋后的血液，血液和Ficoll液分層明顯為成功；

3.將樣本小心轉(zhuǎn)移到離心機(jī)，500 g離心25 min；

4.小心取出離心管，棄掉上層黃色的液體，吸取中間層的白色薄膜層，即為PMBC（如圖2）；

圖2 抗凝血中加入Ficoll后圖示（左）；離心分層后圖示（右圖）

1.用10 mL PBS洗滌獲得的PBMC，250 g離心10 min，棄上清；

2.重復(fù)洗滌一次并重懸細(xì)胞備用。

 

注意事項：

①Ficoll和血液（現(xiàn)取現(xiàn)用）在實(shí)驗前恢復(fù)至室溫，防止Ficoll低溫時密度增加和紅細(xì)胞低溫時聚集，以減少PBMC被紅細(xì)胞污染。

②離心傾倒收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于減少細(xì)胞被血小板污染。

2、實(shí)體組織制備成單細(xì)胞懸液：傳統(tǒng)的實(shí)體組織解離成單細(xì)胞懸液的方法有機(jī)械法、酶解法和化學(xué)法。小優(yōu)也為大家整理了這三種方法的原理、適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)（表4）。

 

當(dāng)然，傳統(tǒng)的組織解離方法也不是完全分隔的，比如機(jī)械法和酶解法就可以組合使用，接下來，我們以制備脾臟單細(xì)胞懸液給大家舉個例子：

脾臟單細(xì)胞懸液制備具體步驟：

1.取PBS清洗、且去除過結(jié)締組織的脾臟組織，放在含冰冷PBS的培養(yǎng)皿中，將脾臟組織剪成約10mm3小塊；

2.使用研杵將組織研磨成單細(xì)胞懸液或加入終濃度為100 µg/mL的DNAse I，室溫孵育5 min；

3.將上述混合物轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，4℃，500g，離心5 min；

4.棄上清，加入10 mL PBS洗滌，重懸備用。

 

注意事項：

①機(jī)械法處理組織時，應(yīng)盡量輕柔，以免過度損傷細(xì)胞。

②使用酶解法時，消化時間不宜過短或過長，過短組織解離不充分，過長則影響細(xì)胞狀態(tài)。

另外，最后再給大家推薦一個既解放雙手，又保證實(shí)驗結(jié)果的組織解離神器：美天旎的gentleMACS全自動組織溫和處理器可快速、溫和、安全、自動、便捷和標(biāo)準(zhǔn)化地將組織（如脾臟、肝臟、腫瘤、表皮等）處理成單細(xì)胞懸液，其包含全自動組織解離器、專利解離管和針對不同組織優(yōu)化的解離試劑盒，以及預(yù)設(shè)軟件程序在內(nèi)的整體方案，實(shí)現(xiàn)對不同組織樣本的優(yōu)化解離，確保細(xì)胞的活力、功能和表面表位的完好。

大家是不是覺得到這里樣本制備就是萬事大吉啦，當(dāng)然不是，在大多數(shù)情況下我們都需要對獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)化，包括但不限于：去除死細(xì)胞、碎片、細(xì)胞團(tuán)以及紅細(xì)胞裂解等等。

好啦，樣本制備的內(nèi)容就介紹到這里啦，下一個細(xì)胞分選，咱們不見不散！