期刊：Nature Communications
影響因子：16.6

導(dǎo)語(yǔ)
賁門失弛緩癥（AC）是由腸梗膜神經(jīng)元逐漸變性引起的食道運(yùn)動(dòng)障礙。免疫介導(dǎo)的神經(jīng)節(jié)炎被認(rèn)為是腸脊髓神經(jīng)元丟失的基礎(chǔ)。使用scRNA-seq測(cè)量賁門失弛緩癥中成對(duì)食管下括約�。↙ES）組織和血液樣本的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜。鑒定了擴(kuò)增的免疫細(xì)胞模式和特定的轉(zhuǎn)錄表型，特別是在LES組織中。展示了C1QC+巨噬細(xì)胞和組織駐留記憶T細(xì)胞（TRM），特別是ZNF683 + CD8 + TRM和XCL1 + CD4 + TRM，在賁門失弛緩癥LES組織中的肌叢周圍顯著擴(kuò)增和定位。C1QC+巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞相似，并且在賁門失弛緩癥中具有神經(jīng)退行性功能障礙表型。TRM還表達(dá)賁門失弛緩癥中免疫反應(yīng)失調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。此外，炎癥隨著疾病進(jìn)展而增加，因?yàn)榕cII型賁門失弛緩癥相比，免疫細(xì)胞在I型中更活躍。因此本文分析了免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄景觀，并將C1QC +巨噬細(xì)胞和TRM鑒定為賁門失弛緩癥中與疾病相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群。

研究重點(diǎn)
Sc-RNAseq，scBCR，scTCR

技術(shù)路線

研究?jī)?nèi)容
1.賁門失弛緩癥患者和對(duì)照組組織和血液中免疫細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)
對(duì)9例賁門失弛緩癥患者和4名組織和血液樣本配對(duì)的對(duì)照組，以及2名僅具有外周血樣本的賁門失弛緩癥患者進(jìn)行了scRNA-seq和TCR，BCR測(cè)序，獲得了137,346個(gè)細(xì)胞的原始數(shù)據(jù)以進(jìn)行進(jìn)一步分析，包括71,450個(gè)外周血單核細(xì)胞（PBMC）和65,896個(gè)組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。這些細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞的中位數(shù)為1500個(gè)基因。通過(guò)scRNA-seq繪制了每個(gè)人的主要免疫細(xì)胞的景觀。
 

2. 髓系細(xì)胞亞群的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)
通過(guò)對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的亞聚類，鑒定出11個(gè)簇，包括7個(gè)單核/巨噬細(xì)胞簇和3個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞( DCs )簇，以及1個(gè)肥大細(xì)胞(圖2a , b)簇�；�于經(jīng)典標(biāo)記，單核/巨噬細(xì)胞被鑒定為Macro1 ( C1QC + )，Macro2 ( CXCL3 + )，Macro3 ( FOShigh )，Macro4 ( CCL20 + )，Mono1 ( CD14 + S100A8高表達(dá),為經(jīng)典單核細(xì)胞)，Mono2 ( CD14 + ITGA4高、中單核細(xì)胞)和Mono3 ( FCGR3A [ CD16 ] + ,非經(jīng)典單核細(xì)胞) (圖2c , d )
 

圖2

3. 在賁門失弛緩癥中，C1QC +巨噬細(xì)胞顯著擴(kuò)大并與多種神經(jīng)退行性和行為障礙通路相關(guān)
與對(duì)照組相比，賁門失弛緩癥中C1QC +巨噬細(xì)胞顯著擴(kuò)增。此外，多色I(xiàn)HC還證實(shí)C1QC +巨噬細(xì)胞在賁門失弛緩癥中擴(kuò)張并位于LES的肌間神經(jīng)叢(以PGP9.5表示)周圍或可能浸潤(rùn)(圖3e )，提示其與腸神經(jīng)系統(tǒng)( ENS )具有潛在的相關(guān)性。進(jìn)一步的CyTOF分析顯示，賁門失弛緩癥患者LES中C1QC +巨噬細(xì)胞的比例有增加的趨勢(shì)。C1QC +巨噬細(xì)胞中富集了多種代謝通路，尤其是氧化磷酸化，在c DC2中也高表達(dá)。此外，對(duì)LES整體組織質(zhì)譜檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，證實(shí)了C1QC +巨噬細(xì)胞(圖3h)的KEGG通路。C1QC +巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上與小膠質(zhì)細(xì)胞相似，并在賁門失弛緩癥中表現(xiàn)出神經(jīng)退行性功能失調(diào)的表型�？偟膩�(lái)說(shuō)C1QC +巨噬細(xì)胞在賁門失弛緩癥中顯著擴(kuò)增，并與多種神經(jīng)退行性和行為障礙通路相關(guān)。
 

圖3

4. 賁門失弛緩癥中克隆性擴(kuò)增，但TCR組庫(kù)的多樣性降低
由于TRM在賁門失弛緩癥中表現(xiàn)出失調(diào)的免疫反應(yīng)，接下來(lái)探索了T細(xì)胞的TCR組庫(kù)。發(fā)現(xiàn)組織中克隆擴(kuò)增的TCR組庫(kù)比血液中克隆擴(kuò)增的TCR組庫(kù)多，賁門失弛緩癥中克隆擴(kuò)增的TCR組庫(kù)比對(duì)照(圖4a)多。與TCR克隆性43呈正相關(guān)的Gini指數(shù)在賁門失弛緩癥中顯著高于對(duì)照組(圖4b )。與TCR多樣性43呈正相關(guān)的Shannon ' s熵指數(shù)在賁門失弛緩癥中顯著低于對(duì)照組(圖4b )。這些結(jié)果表明賁門失弛緩癥中T細(xì)胞的克隆性增殖明顯，但TCR組庫(kù)的多樣性降低，與先前的研究一致

圖4

5. 賁門失弛緩癥中B細(xì)胞無(wú)明顯克隆性增殖，其特征是C1QC +巨噬細(xì)胞與TRM之間的相互作用發(fā)生改變
91 %的B細(xì)胞無(wú)明顯克隆性增殖。具有3個(gè)以上BCR克隆的B細(xì)胞僅存在于賁門失弛緩癥的血液中。表明B細(xì)胞在賁門失弛緩癥中沒(méi)有明顯的克隆性增殖。此外，許多共抑制分子，包括PDCD1，HAVCR2，LAG3，ICOS，PRDM1和MAF，在TRM中顯著下調(diào)(圖5d )，支持了賁門失弛緩癥中的活化細(xì)胞狀態(tài)。GO和KEGG分析顯示，TRM、GZMK + CD8 + T細(xì)胞和GNLY + CD8 + T細(xì)胞在多個(gè)功能類別中相互富集，包括T細(xì)胞活化、對(duì)干擾素- γ的反應(yīng)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)( GO分析)，以及Th1和Th2細(xì)胞分化、細(xì)胞粘附分子、多種免疫性疾病( KEGG分析) (圖5e )。吞噬體和抗原加工遞呈通路的高度富集可能是HLAs (圖5d , e)高表達(dá)的結(jié)果，提示特異性T細(xì)胞活化。
 

圖5

研究重點(diǎn)
在這項(xiàng)研究中，繪制了賁門失弛緩癥和對(duì)照組外周血和配對(duì)LES組織中免疫細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜。鑒定了賁門失弛緩癥中的免疫細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄組。賁門失弛緩癥的LES組織中富集C1QC +巨噬細(xì)胞和TRM，尤其在LES的肌間叢周圍甚至浸潤(rùn)。通過(guò)多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)賁門失弛緩癥患者和對(duì)照組單個(gè)免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜顯示了疾病特異性的免疫細(xì)胞組成和轉(zhuǎn)錄表型，尤其是LES組織中的免疫細(xì)胞，可能參與了賁門失弛緩癥的炎癥過(guò)程。C1QC +巨噬細(xì)胞和TRM在賁門失弛緩癥的LES組織中顯著擴(kuò)張并定位于肌間神經(jīng)叢周圍。C1QC +巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上與CNS的小膠質(zhì)細(xì)胞相似，并表現(xiàn)出神經(jīng)退行性功能障礙的表型。TRM還表達(dá)了賁門失弛緩癥中失調(diào)的免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)潛在的相互作用，C1QC +巨噬細(xì)胞和TRM可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)炎和肌間神經(jīng)元的丟失。肌間神經(jīng)元的丟失可導(dǎo)致食管蠕動(dòng)異常，食管擴(kuò)張，LES松弛功能受損，最終導(dǎo)致賁門失弛緩癥的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：
Liu ZQ, Dai H, Yao L, Chen WF, Wang Y, Ma LY, Li XQ, Lin SL, He MJ, Gao PT, Liu XY, Xu JX, Xu XY, Wang KH, Wang L, Chen L, Zhou PH, Li QL. A single-cell transcriptional landscape of immune cells shows disease-specific changes of T cell and macrophage populations in human achalasia. Nat Commun. 2023 Aug 4;14(1):4685. doi: 10.1038/s41467-023-39750-5. PMID: 37542039; PMCID: PMC10403544.