免疫組化IHC實驗流程介紹
瀏覽次數(shù):913 發(fā)布日期:2023-10-4
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免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術IHC (immunocytochemistry) 是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原 (多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及定量的研究。它是組織化學的分支,它是用標記的特異性抗體 (或抗原) 對組織內抗原 (或抗體) 的分布進行組織和細胞原位檢測技術。
免疫組化的標本主要是組織標本和細胞標本兩大類。組織標本中包括石蠟切片(標本制作的 shou 選方法)和冰凍切片。一般而言,石蠟切片要求薄厚均勻,切片完整,且無褶無刀痕,相當考驗實驗人員的刀工,建議找專業(yè)培訓過的人員或公司進行切片。
1、脫蠟與水化:將石蠟切片放置于 60°烤箱烤片 30-60 min,這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化,好讓組織切片牢固地貼在玻片上。而后依次將其放入二甲 benI、II、III 各 10 min,乙醇梯度(高至低:100%、95%、80%、70%)各 2 min,水洗 5 min(不要直接對著切片沖洗)。PBS 洗 3 次,3 min/次。
2、細胞通透與封閉:用預熱的封閉通透液(40 ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2)浸潤切片 30 min(RT 避光),降低內源性過氧化物酶的活性。PBS 洗 3 次,3 min/次。
3、抗原修復:由于制作石蠟切片時,甲醛固定使得蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用從而失去抗原性,這一步就是讓胞內的抗原決定簇重新「滿血復活」。
小魚常用的是微波修復,pH 6.0 的 0.01M 檸檬酸鈉緩沖液浸泡切片,在微波爐里高火 4 min 至沸騰后,取出自然冷卻至室溫,重復 2 次,每次補足液體以免干片。(當然有的朋友用酶修復法也是可以的)。PBS 洗 3 次,3 min/次。
4、血清封閉:用與二抗同一來源的血清封閉一些非特異性結合位點。此時可用「zhu 傳」的油性筆圍繞組織畫圈,并對圈內的組織滴加稀釋好的血清,37℃ 溫箱中 30 min, 用濾紙吸去多余的血清。
5、孵育一抗:對圈內的組織(面積為 1×1)滴加稀釋好的一抗 20ul,4℃ 過夜或者 37℃ 1-2 h。PBS 洗 3 次,3 min/次。(一般 4℃ 過夜后,需要將切片放置 37℃ 復溫 45 min,防止脫片以及可使抗原抗體結合的更穩(wěn)定)
6、孵育二抗:對圈內的組織(面積為 1×1)滴加稀釋好的二抗 20ul,37℃ 1-2 h,PBS 洗 3 次,3 min/次。
7、切片顯色:用 DAB-H2O2 顯色 10 min,顯色液最好是現(xiàn)用現(xiàn)配,此時要通過顯微鏡觀察染色是否明顯,10 min 內即可用蒸餾水終止顯色。
8、復染及封片:為了形成細胞輪廓,更好的定位目標蛋白,可用 Mayer 蘇木素染色 30s,水洗,鹽酸酒精分化 2s,流水浸入 15 min。脫水時,乙醇梯度(由低至高:50%、70%、95%、100%)各 2 min。二甲 ben 5 min 使切片透明化,最后加入中性樹膠封片(一般封片后最好立即拍照,若不能及時拍照,可用指甲油封固并保持好避光和濕度)。